馬桑提取物促進大鼠燒傷創面愈合的作用和機制*

黃德彬， 胡澤華， 余昭芬， 劉可云

燒傷是最常見的損傷性疾病之一［1］。當今對于Ⅱ°燒傷創面治愈最有價值的治療方法就是用藥物等方法控制感染和促進上皮再生，如最流行的治療燒傷的10%磺胺脒隆軟膏、1%磺胺嘧啶銀霜以及聚維酮碘乳膏等［2］。馬桑提取物(Coriaria sinica Maxim extract，CSME)是馬桑科(Coriariaceae)植物的水提取物，其主要成分為馬桑毒素(coriamyrtin)、羥基馬桑毒素(tutin)、馬桑寧(corianin)等［3］。馬桑水提取物有抗驚厥、抗感染、殺蟲、清熱解毒和生肌等功效，在我國民間常作為草藥用于治療精神分裂癥、風濕麻木、牛皮癬、燒傷以及經久不愈的皮膚潰瘍等［3-4］。而目前對于馬桑提取物治療燒傷創面愈合效果的研究未見報道，因此，我們研究了其對大鼠皮膚Ⅱ°燒傷模型的治療效果和初步機制。現報道如下。

材料和方法

1 材料

1.1 材料與試劑 馬桑原生植物，九月采伐兩年生枝條，經過植物學家鑒別。磺胺嘧啶銀軟膏(silver sulfadiazine，SSD;山東健康藥業有限公司);硫化鈉和白凡士林(white petroleum jelly，WPJ;杭州恒潤有限公司);苦味酸、甲醛溶液、鹽酸、乙酸、生理鹽水和乙醇(購于天津科密歐化學試劑有限公司);鹽酸替來他明和鹽酸唑拉西泮(山東中亞藥業有限公司);丙二醛(malondialdehyde，MDA)放射免疫試劑盒(北京北方生物技術研究所，No.20101020);大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)ELISA定量試劑盒購于上海源碩生物技術有限公司，Sigma產品;Trizol試劑(100 mL/瓶，Dako);RT-PCR 試劑盒(Roche)。

1.2 儀器 EG1150-H石蠟包埋機、RM2245切片機和DM2000顯微鏡(德國徠卡);Pharmacia Gene Quant II型RNA/DNA檢測儀(Pharmacia Gene Quant Pro);S-450D超聲波細胞破碎儀(美國PhD國際科技有限公司);TP600型PCR基因擴增儀(TaKaRa);3K30型低溫高速離心機(Sigma);F200酶標儀(瑞士帝肯);DHV-1201-X恒溫箱、精密移液器、一次性吸頭和YLS-5Q燙傷儀(天津科技發展有限公司);乙二胺四乙酸管 (BD Vacutaine，Becton Dickinson Inc.)。

1.3 cDNA合成引物 Ⅰ型前膠原蛋白cDNA上游引物5'-AGGGACACAGAGGTTTCAGTG-3'，下游引物5'-ACCATTGGCACCTTTAGC-3'，擴增片段 420 bp;βactin上游引物5'-CCCATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'，下游引物 5'-GGCAGGGATGATGTTCTGGAGAGCC-3'，擴增片段長度 410 bp［5］。

2 方法

2.1 馬桑提取物軟膏的制備 取1 kg馬桑枝條粉碎成粉末，作為提取樣品，將樣品用1 000 mL蒸餾水浸泡30 min后，煎煮90 min分別提取3次，將3次提取物合并、過濾和濃縮至100%的馬桑提取浸膏，1 mL浸膏相當于10 g生藥。隨后，按CSME與普通醫用白凡士林10∶2比例混合成外用燒傷軟膏。

2.2 藥物敷料的制備 藥物敷料包括馬桑提取物軟膏敷料(CSME-dressing)、磺胺嘧啶銀軟膏敷料(SSD-dressing)和白凡士林軟膏敷料(WPJ-dressing)。CSME-dressing和 WPJ-dressing就是將 CSME和WPJ分別用平板電爐加熱滅菌后，均勻涂抹于1塊無菌敷料上而制得。同樣地，不用加熱直接制得SSD-dressing。所有藥物敷料分別含相應藥物大約0.5 g/cm2。

2.3 燒傷動物模型制造與治療 SD雄性大鼠(6周，180～220 g)來源于重慶醫科大學實驗動物中心(中國重慶，No.41110252)，在溫度(24 ±3)℃和濕度(50±5)%狀態下，自由適應12 h陽光與陰影的晝夜節律1周。隨機將動物分成對照組(NS)、白凡士林組(WPL)、磺胺嘧啶銀組(SSD)、馬桑提取物組(CSME)，每組10只。常規配方飼料喂養和自來水飲水。所有動物都保持在晝夜周期(12 h光照，12 h黑暗)的標準實驗室條件下的動物房內，溫度為(24±3)℃。自由攝取食物和水。動物治療嚴格按照國家衛生實驗動物護理和使用指南進行。在學院實驗動物管理委員會的監督下進行實驗。將大鼠腹腔注射2 mL/kg替來他明－唑拉西泮麻醉(Zoletil?，替來他明125 mg/5 mL+唑拉西泮125 mg/5 mL)。檢查動物狀況后，用電剪剪去背部毛約4 cm ×4 cm范圍，而后將剪毛區域用8%硫化鈉脫毛，且用75%乙醇消毒。用恒溫恒壓燙傷儀加500 g壓力燙傷脫毛區15 s(2.5 cm × 2.5 cm，90℃)。24 h后取創面組織切片，經HE染色證實為深Ⅱ度燙傷，燙傷動物模型制成備用。之后，各組動物創面分別用NS敷料、WPJ敷料、SSD敷料和CSME敷料覆蓋治療，每天更換藥物敷料2次。總共治療21 d。

2.4 觀察內容 在第1 d、3 d、7 d 、14 d、21 d 觀察各組動物臨床癥狀和創面狀況，如創面色澤、大小、滲出物、結痂及被毛等。此外，測量創面上皮化率(epithelization rate，ER)，包括原始創面面積(primordial area，PA)和未愈創面面積(no healing area，NHA)。計算方法是:ER(%)=(PA-NHA)/PA×100%。

2.5 組織學研究 分別于燒傷后第1 d、3 d、7 d、14 d和21 d取出創緣3、6、9和12時點的創基組織(頭尾方向分別為12和6時點，包括部分正常組織)，一部分放入液氮中用于細胞因子檢測，另一部分用10%甲醛溶液固定，薄片組織石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察，評價組織改變情況。

2.6 MDA含量與SOD活性測定 先用勻漿機將創基組織勻漿，取上清液樣品，嚴格按試劑盒說明書檢測MDA和SOD活性，在波長586 nm檢測吸光度(A)。

2.7 創面組織表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，bFGF)蛋白水平的檢測 分別稱取各組創基組織置于玻璃勻漿器內，按每1 mg組織加1 mL蛋白提取液稀釋后，用勻漿機勻漿200次，將勻漿液置于40℃恒溫箱30 min后，吸取勻漿液置于離心管中12 000 r/min離心20 min。取上清液分析細胞因子的表達，如EGF和bFGF，相應地按ELISA試劑盒說明書進行分析。在波長450 nm檢測吸光度(A)，檢測上限分別是80 ng/L和100 ng/L。

2.8 創面Ⅰ型或Ⅲ型膠原mRNA表達的檢測 用PCR級器械留取創基組織樣品，迅速保存在－80℃冰箱內備用。分別將樣品用DNA/RNA測定儀測定波長為A260/A280吸光度值(在1.8～2.0范圍內)與RNA濃度。用RT-PCR一步法完成mRNA擴增和檢測。將蛋白cDNA引物上、下游設計跨2個外顯子。為保證mRNA擴增的穩定性和特異性，以500 bp擴增片段作為推薦長度。設置陰性對照和內對照組，以便排除RNA非特異性擴增和降解所導致的誤差。為確定各待測模板樣品指數增長期的起始拷貝數，設置3個數量級的標準對照，制備標準曲線，測定mRNA的表達值。

3 統計學處理

用SPSS 11.0軟件。數據用均數 ±標準差(Mean±SD)表示，均數比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CSME對燒傷大鼠創面愈合的影響

燒傷后第1 d和3 d，各組創面臨床癥狀和ER相當，無顯著差異(P＞0.05);在第3 d，CSME組中少數動物創面中央顏色暗紅。第7 d，各組創面ER相當，無顯著差異(P＞0.05)，NS和WPJ組創面濕潤呈暗紅色結痂，少數動物創面有微量滲出液。但CSME和SSD組創面干燥呈褐色結痂，無滲出液，在CSME組中少數動物創緣有脫痂之趨勢。

第14 d，各組創面干燥呈褐色或黑色結痂，創面開始縮小;SSD組創緣開始脫痂，創緣新生上皮生長活躍，有少量新生被毛生長，創面中央滲液少，其ER明顯高于NS和WPJ組(P＜0.05);CSME組創緣明顯有脫痂，新生上皮生長高度活躍，有大量新生被毛生長，創面中央滲液少，其ER明顯高于SSD組(P＜0.05);NS和 WPJ組無脫痂之勢，ER相當 (P＞0.05)，創面中央滲液明顯多于SSD和CSME組。

第21 d，NS和WPJ組創面中央尚有少許未脫落的黑色結痂［(0.42 ±0.08)cm2和 (0.47 ±0.06)cm2］，ER 為83.14% ±2.33%和 81.09% ±3.12%，創面周圍大部分被新生上皮覆蓋，有大量被毛生長;SSD與CSME組創面完全愈合，ER為98.67% 和100%。其中，SSD組創面中央新生被毛稀疏而細小，而CSME組創面中央被毛密集，大部分被毛接近正常，見圖1。

Figure 1.Effects of CSME on ER of burn wounds in rats.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05 vs SSD group.△P ＜0.05 vs NS or WPJ group.圖1 CSME對大鼠燒傷創面ER的影響

2 CSME對燒傷創面組織學的影響

第1 d和3 d，各組病理學觀察相當。傷后第7 d，各組創面組織學檢查結果稍有不同。在NS和WPJ組中，病理學觀察相當;其真皮層充血、水腫明顯，纖維中有大量炎癥細胞浸潤;膠原纖維顯著腫脹、融合，原纖維結構消失;表皮細胞缺如，組織生長不明顯;大量組織細胞變性壞死，絕大多數細胞漿濃縮，細胞核固縮。在SSD組中，可見真皮層充血、水腫較輕，纖維中有較多炎癥細胞浸潤;膠原纖維腫脹，離散與融合交替，原纖維結構少量殘存;表皮細胞缺如，組織生長不活躍，中等量的組織細胞變性壞死，半數細胞漿濃縮，細胞核固縮。在CSME組中，可見真皮層充血、水腫輕微，纖維中有少數炎癥細胞浸潤;所有膠原纖維輕微腫脹，無融合，原纖維結構殘存較多;有少數表皮細胞，組織生長較活躍，有少數組織細胞變性壞死，少數細胞漿濃縮，細胞核固縮。

第14 d，各組創面組織學檢查結果明顯不同。NS組與WPJ組大致相當:外圍有小范圍壞死組織溶脫，少數肉芽組織裸露;可見真皮層輕度充血、水腫，纖維中有少量炎癥細胞浸潤;少數膠原纖維輕度腫脹、融合，原纖維結構完整;創面外圍表皮細胞有限覆蓋，上皮組織生長活躍，少數組織細胞變性壞死，無細胞漿濃縮和細胞核固縮。在SSD組中，創面外圍有部分壞死組織溶脫以及肉芽組織裸露;真皮層無充血、水腫，有少量白細胞浸潤;膠原纖維無融合，原纖維結構完整;外圍表皮細胞廣泛覆蓋，上皮組織生長活躍，有少數組織細胞變性壞死，無細胞漿濃縮與細胞核固縮。在CSME組中，創面外圍普遍壞死組織溶脫，肉芽組織裸露;真皮層有個別白細胞浸潤，無充血、水腫;膠原纖維結構完整，無腫脹，無融合;外圍表皮細胞廣泛覆蓋，上皮細胞生長極其活躍，無細胞變性壞死、細胞漿濃縮和細胞核固縮。

第21 d，各組創面組織學檢查結果有顯著差異。在NS和WPJ組中，創面近愈合，中央區域上皮分化差，炎癥細胞浸潤明顯，組織結構不清淅;在SSD和CSME組中，所有創面完全愈合;其中，SSD組創面中央區域被分化良好的單層上皮細胞覆蓋;大量膠原纖維增生，不規則排列，組織結構模糊，皮脂腺和毛囊增生活躍;而CSME組鏡下可見全部被多層上皮細胞覆蓋，新生膠原纖維充分分化，排列整齊，組織結構明朗，皮脂腺和毛囊增生極其活躍等，見圖2。

3 CSME對燒傷大鼠創面MDA含量和SOD活性的影響

各組大鼠在燒傷后，從第1 d到21 d，MAD含量逐漸降低，NS、WPJ和SSD組相當，無顯著差異(P＞0.05)。在第3 d、7 d、14 d 和21 d，CSME 組的 MDA含量均低于其它各組(P＜0.05)，見表1。

從第1 d到21 d，各組大鼠在燒傷后，SOD活性隨時間逐漸增強，NS、WPJ和SSD組相當，無顯著差異(P ＞0.05)。在第3 d、7 d、14 d和21 d，CSME 組的SOD活性均強于其它各組(P＜0.01)，見表2。

Figure 2.Effects of CSME on pathological changes of burn wounds in rats on the 21st day(HE staining).圖2 CSME對大鼠燒傷第21 d創面病理變化的影響

表1 CSME對燒傷大鼠創面MAD含量的影響Table 1.Effects of CSME on MDA content of burn wounds in rats(mean±SD.n=10)

表2 CSME燒傷大鼠創面SOD活性的影響Table 2.Effects of CSME on SOD activity of burn wounds in rats(mean±SD.n=10)

4 CSME對燒傷大鼠創面EGF和bFGF蛋白水平的影響

燒傷后從第1 d到21 d，各組大鼠EGF蛋白水平為先升高后降低，在第3 d和7 d達最高峰，遠高于其它時點(P ＜0.05 或 P ＜0.01)。其中，NS、WPJ和SSD組的EGF水平相當，無顯著差異(P＞0.05)。但CSME組在第3 d和7 d的EGF蛋白水平顯著高于其它各組，在第14 d和21 d迅速下降，低于其它組(P ＜0.05 or P ＜0.01)，見圖 3。

Figure 3.Effects of CSME on protein level of EGF of burn wounds in rats.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs other groups.圖3 CSME對大鼠燒傷創面EGF蛋白水平的影響

第3 d，CSME組的bFGF蛋白表達顯著高于其它各組，在第7 d、14 d和21 d迅速下降，顯著低于其它組(P ＜0.05或 P ＜0.01)，見圖4。

Figure 4.Effects of CSME on protein level of bFGF of burn wounds in rats.Mean ±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs other groups.圖4 CSME對大鼠燒傷創面bFGF蛋白水平的影響

5 CSME對大鼠燒傷創面Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達的影響

第14 d，大鼠正常組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達的總含量均顯著低于其它組燒傷創面組織(P＜0.05)。對于Ⅰ型膠原mRNA表達，SSD組顯著高于其它各組，CSME組顯著高于正常組織而低于NS和WPJ組，但Ⅲ型膠原mRNA表達則相反。SSD組Ⅰ型與Ⅲ型膠原mRNA表達的比值顯著高于其它各組和正常組織，CSME組顯著低于其它各組和正常組織(P＜0.05)，而正常組織、NS組和WPJ組之間無顯著差異(P＞0.05)。這表明CSME在抑制燒傷創面Ⅰ型膠原和增強Ⅲ型膠原mRNA表達方面起著重要作用，見圖5、表3。

Figure 5.The mRNA expression of typeⅠ andⅢ collagen in normal and scar tissues on the 14th day after burn in rats.圖5 大鼠燒傷后第14 d正常和疤痕組織Ⅰ和Ⅲ型膠原mRNA的表達

表3 第14 d CSME對大鼠燒傷創面Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達的影響Table 3.Effects of CSME on mRNA expression of typeⅠandⅢcollagen in burn wounds on the 14th day after burn in rats(mean±SD.n=10)

討 論

目前控制燒傷創面感染、促進創面愈合和抑制病理性瘢痕增生是現代醫學的一大難題［6-8］。臨床常用的磺胺嘧啶銀只能用以控制創面感染，不能促進燒傷創面愈合和抑制創面病理性疤痕增生［9-10］。在中國民間，馬桑水提取物被用作治療經久不愈的皮膚潰瘍和燒傷創面愈合［11］。有報道，其對燒傷創面常見感染耐藥菌有顯著抑制作用［12］。本實驗發現，CSME有促進大鼠燒傷創面愈合作用。燒傷后第14 d，CSME組新生上皮生長高度活躍，有大量新生被毛生長，燒傷后第21 d，CSME組創面中央被毛密集，大部分被毛接近正常，創面上皮化速率明顯高于SSD組，差異顯著(P＜0.05)。

1 CSME影響SOD活性和MDA含量，維護燒傷創面組織細胞的代謝與功能，阻止細胞凋亡

燒傷后，機體通過非酶系統與酶系統產生氧自由基，產生的氧自由基可破壞生物膜的多不飽和脂肪酸，誘發脂質過氧化反應［13-14］。這種脂質過氧化反應可將活性氧轉化為非自由基性的脂質產物，通過鏈式反應放大活性氧作用，產生MDA、羥基、酮基、羰基、氫過氧基等多種脂質過氧化物［15］。其中，MDA能引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合而導致細胞毒性作用，伴隨細胞代謝紊亂與功能障礙，甚至凋亡［16］。因此，MDA含量可反映燒傷創面組織脂質過氧化的程度而間接體現細胞損傷的程度。SOD能通過清除氧自由基而阻止其誘發的脂質過氧化反應，保護細胞免受損傷。SOD是機體內清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，其活性強弱可直接反映機體清除氧自由基的能力［17］。本研究發現，在第3 d、7 d、14 d和21 d，CSME 組的 MDA 含量低于其它各組，但SOD活性高于其它各組(P＜0.05，P＜0.01)。因此，CSME促進燒傷創面愈合作用與增強SOD活性和抑制MDA的生成、以維護燒傷創面組織細胞的代謝與功能有關。

2 CSME調控燒傷創面EGF和bFGF蛋白水平，縮短創面修復進程和阻止創面疤痕形成

EGF是人體皮膚內與生俱來的物質，其通過多種細胞因子的磷酸化，將生物信息轉導至胞內［18］。EGF可增強糖的酵解，通過激活RNA轉錄、蛋白質與DNA的合成，而促進表皮細胞的增殖分化［15］。有報道，EGF還可增強細胞凋亡抑制基因bcl-2的功能，防止細胞內DNA的斷裂，避免細胞變異與凋亡［12］。這說明，燒傷創面組織的EGF含量，能直接體現燒傷創面修復的活躍程度。單拷貝基因bFGF編碼155個氨基酸，位于第5對染色體上，是促有絲分裂的陽離子多肽［16］。bFGF與受體結合后，一方面，激活腺苷酸環化酶和鳥苷酸環化酶，最終激活蛋白激酶C，同時增加Ca2+內流而發揮生物學效應;另一方面，在細胞核內激活RNA聚合酶Ⅰ，增加核蛋白體基因轉錄，增強DNA合成，繼而促進細胞由G0期向G1期，最終轉向S期，增強細胞的有絲分裂［17］，促進組織再生修復、加快創傷愈合，還參與神經再生以及充當血管生長因子等［13］。因此，bFGF在促進燒傷創面修復的同時，對于創面疤痕形成也起著重要作用［18］。本研究顯示，燒傷后從第 1 d到 21 d，CSME早期EGF和bFGF表達顯著高于其它各組，后期迅速下降，低于其它組(P＜0.05或 P＜0.01)。因此，CSME促進燒傷創面愈合作用，與早期增強EGF和bFGF水平有關，而創面愈合后，在瘢痕形成期則阻止其含量增加，減少瘢痕形成。

3 CSME調控燒傷創面Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達，在促進創面愈合的同時，抑制病理性瘢痕增生

存在于皮膚中的膠原纖維主要為Ⅰ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型膠原纖維粗大，位于真皮淺層，是燒傷創面瘢痕組織纖維化的物質基礎。有研究發現，在質地堅硬而無彈性的瘢痕組織中，可見大量Ⅰ型膠原纖維沉著［11］。Ⅲ型膠原纖維細小，主要位于真皮的深層［16］。有報道，在胎兒無瘢痕愈合的多種影響因素中，Ⅰ型膠原纖維含量很低，Ⅲ型膠原纖維含量很高［15］。因此，Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維含量比與燒傷創面無瘢痕愈合呈現負相關［17］。燒傷愈合過程中，一般在第14 d膠原纖維表達最為活躍，與疤痕形成密切相關［12］。本研究發現，在第14 d，創面組織學研究證實，與SSD組相比，CSME組膠原纖維相對細小，分化良好，排列整齊;大鼠正常組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達的總含量均顯著低于其它組燒傷創面組織(P＜0.05);在Ⅰ型與Ⅲ型膠原mRNA表達的比值方面，SSD組顯著高于其它各組和正常組織，CSME組顯著低于其它各組和正常組織(P＜0.05)，而正常組織、NS組和WPJ組之間無顯著差異(P＞0.05)。這表明CSME在抑制燒傷創面Ⅰ型膠原而增強Ⅲ型膠原mRNA表達方面起著重要作用，其在促進燒傷創面愈合的同時，也通過調控Ⅰ型與Ⅲ型膠原mRNA表達比值而阻止病理性瘢痕的過度增生。

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