NALP3富含亮氨酸重復序列結構域識別人細胞周期蛋白H和禽冠狀病毒蛋白*

顏 亮， 羅 滔， 蔡軍偉， 畢志斐， 胡巢鳳

(1暨南大學醫學院病理生理學教研室，國家中醫藥管理局病理生理學實驗室，廣東廣州510632;2南方醫科大學病理生理學教研室，廣東廣州510515;3山西醫科大學人體解剖學教研室，山西太原030001)

固有免疫(innate immunity)是多細胞生物抗御 病原體感染和抗腫瘤的第一道防線。固有免疫細胞通過表達模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，啟動機體的生物防御機能。Toll樣受體［1］(Toll-like receptors，TLRs)是發揮固有免疫功能的關鍵PRRs，主要識別細胞外或作用于細胞表面的PAMPs，例如細菌脂多糖、肽聚糖、胞壁酸、病毒雙鏈RNA、細菌鞭毛蛋白等，其對PAMPs的識別由TLRs胞外富含亮氨酸的重復序列(leucine rich repeats，LRR)完成［2］。

然而機體在病理條件下也會出現PAMPs相關分子和相似的危險信號，這些PAMPs相關分子和危險信號存在于細胞內，誘發炎癥反應和警示組織損傷。闡明機體對這些細胞內危險信號的識別機制是一個根本性的問題。2000年Hoffman等［3-4］相繼報道了人類常染色體顯性遺傳病家族性冷誘發蕁麻疹(familial cold urticaria，FCU)和MW綜合征(Muckle-Wells syndrome，MWS)的致病基因是編碼NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3(NALP3)的CIAS1基因。CIAS1基因的突變還可引起慢性嬰幼兒神經皮膚關節綜合癥［5］，這些疾病實質上均為自身炎癥性病變，以炎癥復合體(inflammasome)過度激活和產生過量炎癥細胞因子 IL-1β為特征。NALP3又稱 cryopyrin或 PYPAF1/NLRP3，主要在白細胞中表達。NALP3的N端是重要的熱蛋白樣結構域(pyrin domain，PYD)［6］，通過接頭蛋白 ASC 與其下游的信號效應分子相聯系。中部是核苷酸偶聯結構域(domain present in NAIP，CIITA，HET-E and TP-1，NACHT)［7］，具有同屬蛋白寡聚化募集的功能。C端的LRR結構域與TLR胞外段結構相似，由多個重復結構單位呈大致相互反向平行的 β-折疊和 α-螺旋構成，具有分子之間相互作用和配體識別能力［8］。當細胞內信號分子被NALP3的LRR結構域(NALP3-LRR)識別后，引起NALP3的寡聚化和分子活化，與炎癥性凋亡蛋白酶1形成炎癥復合體，參與炎癥細胞因子 IL-1β的生成和機體固有免疫調節［9］。

NALP3能被包括ATP、細菌毒素、病原體代謝產物、尿酸晶體、三硝基氯苯等激活［10-12］，推測其機制與NALP3-LRR結構域對這些細胞內危險信號的識別有關，而NALP3發生基因突變引起自身炎癥性病變則可能導致LRR結構域的識別功能紊亂和NALP3過度活化。至今關于內源性蛋白分子如何與NALP3-LRR結構域相互作用甚少見報道。本研究運用酵母雙雜交技術，以人NALP3-LRR基因序列構建誘餌質粒，對人胚肺文庫進行酵母雙雜交文庫篩選，尋找與NALP3-LRR結構域相互作用的蛋白質分子，為進一步闡明NALP3在固有免疫調節機制中的作用提供新的資料。

材料和方法

1 材料

pMyr人胚肺cDNA文庫質粒(庫容為4×108cfu/L)和pSos質粒(Stratagene)，cdc25H酵母細胞、酵母轉化、酵母質粒提取所需各種試劑及YPAD、SD/glucose(－UL)、SD/galactose(－UL)培養平板，XL1-Blue感受態菌及分子克隆所用的常規試劑均由天津賽爾生物技術有限公司提供。

2 方法

2.1 克隆NALP3-LRR的cDNA序列及構建含有NALP3-LRR序列的pSos誘餌質粒 人軟骨組織通過液氮研磨，Trizol法提取總RNA，用Oligo dT為引物，MMLV逆轉錄酶進行逆轉錄反應。設計含有BamH I和Sal I酶切位點的PCR引物，克隆NALP3-LRR的cDNA序列。將回收的PCR產物與酶切后的線性質粒16℃連接過夜。提取質粒，酶切鑒定含有NALP3-LRR的陽性克隆。將NALP3-LRR序列與誘餌載體pSos連接，酶切鑒定選擇適當的克隆經測序確認。

2.2 酵母轉化和誘餌蛋白自激活實驗 常規制備感受態細胞，行酵母轉化實驗。設置陽性對照組為pSos MAFB+pMyr MAFB和pSos MAFB+pMyr SB;陰性對照組為pSos MAFB+pMyr Lamin C和pSos Col I+pMyr MAFB，只有在galactose存在的前提下才能激活報告基因的表達。為了驗證Bait蛋白NALP3-LRR是否具有自激活能力，設置轉化組別為:pSos bait(用于排除bait蛋白自身可定位于膜上)，pSos bait+pMyr SB(驗證蛋白位于胞漿中)，pSos bait+pMyr或pMyr Lamin C(排除bait蛋白可能與myristlyation signal結合)。將在 25 ℃ SD/glucose(－UL)平板上生長的酵母菌挑取在DDW中渦旋后各滴于 SD/glucose(－UL)和 SD/galactose(－UL)的平板上，25℃ 和37℃觀察4～6 d。

2.3 感受態酵母菌的制備及質量評價 使用2個對照平板來檢測溫度敏感突變體的突變頻率。第1對照組將75 μL用來制備酵母感受態的酵母培養物鋪于YPAD完全培養平板上，在37℃孵育6 d，出現5個克隆(小于30個克隆)，說明培養物中溫度敏感突變體的數量合格。第2對照平板為共轉化pSos和pMyr的酵母細胞，37℃孵育6 d，未出現克隆，符合要求。共轉化了pSos和pMyr的酵母細胞，在25℃孵育的SD/glucose(－UL)平板上生長的克隆數為130左右。按公式計算轉化效率為1.3×103cfu/μg，符合轉化效率應在0.5 ×103～1 ×104cfu/μg的要求。

2.4 酵母的文庫篩選實驗 將NALP3-LRR-pSos質粒和pMyr人胚肺cDNA文庫質粒共轉化到酵母的感受態細胞中，將轉化反應混合物鋪在SD/galactose(－UL)瓊脂平板上。25℃倒置孵育平板48 h，隨后轉入37℃孵育。7 d以后，從37℃半乳糖平板上的文庫篩選轉化物中挑取克隆，將細胞重鋪在SD/glucose(－UL)瓊脂平板上，在22～25℃孵育48 h。再將其分別重鋪在2個SD/glucose(－UL)平板和1個SD/galactose(－UL)平板上，其中一個SD/glucose(－UL)平板在25℃孵育作為保存板，另外一個SD/glucose(－UL)平板和SD/galactose(－UL)平板在37℃孵育約48 h。48 h后觀察各個平板的克隆生長情況，找出37℃下在SD/galactose(－UL)平板上生長、而在SD/glucose(－UL)平板上不生長的克隆。將這些克隆再次鋪板，置不同溫度培養，重復驗證后視為可能的陽性克隆。

2.5 陽性克隆的酵母回交驗證實驗 擴增含有陽性克隆的酵母細胞后通過化學及物理裂解的方法提取其中的文庫質粒DNA，轉化上述質粒DNA至大腸桿菌后，分離純化文庫質粒DNA。酶切鑒定文庫質粒DNA中所含外片段的大小進行比對分析。再次共轉文庫與誘餌DNA，對篩選得到的陽性克隆進行回交驗證。最后測序分析陽性克隆的序列并做生物信息學分析。

2.6 NALP3-LRR與陽性克隆基因在293T細胞的共表達和免疫共沉淀驗證 對經酵母文庫篩選獲得的陽性蛋白進行基因序列克隆，構建相應的真核表達載體，經酶切鑒定后送測序確認。用Lipofectamine 2000將含有相關陽性蛋白基因的真核表達載體與含有NALP3-LRR基因的真核表達載體共轉染293T細胞，CO2培養箱37℃ 培養72 h后，裂解細胞提取蛋白。Western blotting檢測相關蛋白在293T細胞中的表達。

分別將NALP3-LRR/pCD3-CMYC與CCNH/pCD3-HA、NALP3-LRR/pCD3-CMYC 與 AIBVORF1a/pCD3-HA、NALP3-LRR/pCD3-CMYC 與PALM3/pCD3-HA共轉染293T細胞，48 h后收獲細胞，加入細胞裂解緩沖液裂解細胞提取蛋白。取 c-Myc單抗交聯蛋白A瓊脂糖珠，用裂解緩沖液洗3次，將預處理過的蛋白A瓊脂糖珠加入和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4℃ 緩慢搖晃孵育4 h，使抗體與蛋白A瓊脂糖珠偶聯。免疫沉淀反應后，4℃、3 000 r/min離心將瓊脂糖珠離心至管底，小心吸去上清，瓊脂糖珠用裂解緩沖液洗，最后加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min。配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠，上樣后100V電壓電泳。電泳分離后的蛋白經電轉移至硝酸纖維素膜上，浸入Blotto封閉液封閉非特異性結合位點，分別與Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育，最后加入化學發光底物檢測顯影，凝膠成像系統拍照。

2.7 用分子模擬軟件Discovery StudioTM(Accelrys)對NALP3-LRR進行三維結構模建，使用Vector NTI Suite軟件、ExPASy的PROSITE數據庫、DTU CBS服務器上的NetPhos 2.0 Server程序和Stanford大學開發的SAPS等工具和數據庫分析NALP3-LRR序列的功能位點。

結 果

1 NALP3-LRR的cDNA序列克隆和NALP3-LRR-pSos誘餌質粒的構建

常規方法提取總 RNA，A260/A280=1.9，經1%瓊脂糖凝膠電泳，28S/18S大約為1∶1～2∶1之間。PCR產物經酶切鑒定片段大小正確，見圖1A。將NALP3-LRR序列與誘餌載體pSos連接，酶切后電泳鑒定，顯示1、3、5號克隆含有大小正確的目的片段，見圖1B，其中1號克隆經測序確認序列無誤，讀碼框正確，用于后續實驗。

Figure 1.Identification of PCR clone of NALP3－LRR cDNA(A)and NALP3－LRR－pSos bait plasmid(B)by enzyme digestion with BamH I and Sal I.M:DNA marker.圖1PCR克隆的NALP3-LRR cDNA序列和NALP3-LRR-pSos誘餌質粒的酶切鑒定

2 酵母轉化和自激活實驗

將cdc25H酵母細胞分別畫線于 SD/－Trp、SD/－Leu、SD/－His、SD/－Ura和 YPDA，22 ～25 ℃下生長4～6 d。結果只在YPDA上長出克隆，其余SD平板上均無克隆出現。將cdc25H酵母細胞分別畫線于2塊YPDA平板，一個放于22～25℃培養，另一個放于37℃培養，共觀察4 d，37℃條件下無菌落生長。

酵母轉化對照實驗表明，只有在galactose存在的前提下才能激活報告基因的表達，實際結果與預期結果相符，見表1。

表1 酵母轉化證實galactose的存在激活報告基因Table 1.Yeast transformation indicated galactose activated the reporter gene

自激活實驗結果顯示，2組轉化后的酵母菌25℃在glucose和galactose平板上均有生長;37℃在glucose平板上，2組均無生長。在galactose平板上，NAPL3-LRR-pSos+pMyr SB生長，而NAPL3-LRR-pSos+pMyr Lamin C不生長，表明NALP3無自激活作用，可用于酵母文庫篩選實驗，見圖2。

Figure 2.The growth of the co-transformants under different conditions for testing the possibility of self-activation by NALP3-LRR.1:NALP3-LRR-pSos+pMyr Lamin C;2:NALP3-LRR-pSos+pMyr SB.圖2 自激活實驗顯示共轉子在不同條件下的生長情況

3 從人胚肺cDNA文庫篩選與NALP3-LRR相互作用的陽性克隆

將NALP3-LRR-pSos質粒和pMyr人胚肺cDNA文庫質粒共轉化后的酵母的感受態細胞按照方法2.4培養，找出37℃下在SD/galactose(－UL)平板上生長，而在SD/glucose(－UL)平板上不生長的克隆，再次驗證后視為可能的陽性克隆，圖3是部分陽性克隆的例子，可見第2號克隆在 SD/glucose(－UL)條件下，25℃能正常生長，37℃則無法生長。該克隆在SD/galactose(－UL)條件下，37℃也能生長。將選中的克隆重新培養篩選驗證，共得到4個陽性克隆。擴增4個陽性克隆的酵母細胞提取其中含有的文庫質粒DNA，轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞后小量提取質粒。用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，片段大小與預測相符。回交實驗進一步證明所選克隆與NALP3-LRR在酵母細胞內有相互作用，見圖4。

Figure 3.Identification and selection of a positive clone.圖3 鑒別和挑選陽性克隆

Figure 4.Further confirmation of the positive clones by the yeast backcross verification.圖4 回交實驗進一步驗證陽性克隆

陽性克隆經測序和生物信息學分析表明，克隆N1為人細胞周期蛋白H(Homo sapiens cyclin H，CCNH);克隆 N2為 Homo sapiens paralemmin-3(PALM3);克隆N5為KRAS，是Cytotrap系統中一背景性假陽性蛋白;克隆N6為禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，AIBV)Ca199毒株的ORF1a蛋白(AIBV-ORF1a)。

4 與NALP3-LRR相互作用的蛋白質在人腎上皮細胞的表達及免疫共沉淀驗證

成功構建相應的真核表達載體NALP3-LRR/pCD3-CMYC、CCNH/pCD3-HA、PALM3/pCD3-HA 和AIBV-ORF1a/pCD3-HA，經酶切后均可見到大小正確的插入片段。測序結果顯示序列正確，無任何突變或缺失，讀碼框正確。轉染293T細胞后，經Western blotting獲得單一清晰條帶證實這些蛋白均能在人腎上皮細胞表達，見圖5。

Figure 5.The expression of positive proteins in 293T cells detected by Western blotting.圖5 蛋白印跡實驗證實篩選的陽性蛋白均能在人腎上皮細胞293T表達

將真核表達載體NALP3-LRR/pCD3-CMYC分別與 CCNH/pCD3-HA、PALM3/pCD3-HA 和 AIBVORF1a/pCD3-HA共轉染293T細胞后，細胞裂解物和經CMYC單抗瓊脂糖珠結合的沉淀物均可檢測到NALP3-LRR蛋白的存在(圖略)。NALP3-LRR基因與CCNH基因共轉染的細胞裂解物和NALP3-LRR基因與AIBV-ORF1a基因共轉染的細胞裂解物經與CMYC單抗瓊脂糖珠結合后，在瓊脂糖珠結合物中均可檢測到2種蛋白的存在，表明2種蛋白之間存在相互作用。NALP3-LRR與PALM3基因共轉染的細胞裂解物與CMYC單抗瓊脂糖珠結合后，在瓊脂糖珠結合物中只能檢測到NALP3-LRR的存在，未檢出PALM3蛋白，表明2種蛋白之間沒有相互作用，見圖6。

Figure 6.Co-immunoprecipitation of NALP3-LRR with the positive proteins.The anti-HA antibody was used as the first antibody for binding to the positive proteins.Lane 1:the sample was the cell lysate before co-IP by Sepharose 4B conjugated with the anti-CMYC antibody;Lane 2:the sample was the precipitates of the cell lysate after co-IP by Sepharose 4B conjugated with the anti-CMYC antibody.圖6 免疫共沉淀實驗確認與NALP3-LRR相互作用的蛋白

5 NALP3-LRR結構域的分子模擬和功能預測

雖然NALP3-LRR結構域富含亮氨酸，但無亮氨酸拉鏈結構。對NALP3的分子基序搜尋顯示N-糖基化位點(N-glycosylation site)主要位于LRR結構域，原核生物膜脂蛋白脂質附著位點(prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site)也位于LRR結構域(第831～841位氨基酸)，并存在12個可能的磷酸化位點。分子結構保守性分析結果表明，LRR結構域在整個NALP3分子中保守性最高。對NALP3-LRR結構域的三維分子模建可見該結構域有典型的TLR胞外PAMPs識別的相似結構，其外緣為α螺旋，內緣為β折疊，兩者交替反相折疊呈馬蹄形。該區負電荷分布占明顯優勢，重心位于近羧基β折疊及β折疊的羧基端轉彎部位，整個模建的負靜電勢分布呈拳擊手套狀，有正電勢分布位于手套掌根部。

討 論

運用酵母雙雜交技術，本文首次發現在酵母細胞和人腎上皮細胞內，人NALP3-LRR結構域蛋白與人細胞周期蛋白H和禽傳染性支氣管炎病毒發生了相互作用。為了確保研究結果的準確性，在實驗過程中采取了嚴格的質量控制措施，所有DNA克隆產物都在酶切鑒定后經序列測定確認，保證序列正確，無任何突變或缺失且讀碼框正確，能表達正確的蛋白質。酵母雙雜交對人胚肺cDNA文庫的篩選每個實驗均設置嚴格對照，排除了NALP3-LRR蛋白自激活的可能性。對能與NALP3-LRR結構域蛋白相互作用的陽性克隆采用了重復實驗、回轉實驗，最后共轉染人腎上皮細胞293T通過免疫共沉淀檢驗方予確認。

NALP3是NALP分子家族的典型代表，其N端是PYRIN結構域，C端是LRR結構域，NACHT結構域位于分子的核心部位，這樣的結構使其既有信號識別能力，又有自身寡聚化和與效應分子形成復合物的功能，是構成炎癥復合體的重要成分。本實驗室曾報道NALP3的NACHT結構域存在能與ATP和Mg2+結合的Walker A和Walker B基序，該基因的主要致病突變點與此結構有密切關系。同時發現LRR區域存在與Ca2+和多糖結合的位點［13］。

對PYRIN結構域的效應關聯機制和NACHT結構域的同源寡聚化已有較多的研究資料，但至今尚缺少關于NALP3-LRR結構域識別PAMPs和與胞內危險信號相互作用的直接證據。雖然大量的研究已明確細胞內多種PAMPs和細胞損傷產生的信號分子可激活NALP3炎癥復合體，這些信號分子是否通過LRR結構域進行識別尚屬推測。本研究證明NALP3-LRR結構域能識別蛋白質分子，這種物理性相互作用對該結構域是NALP3分子的信號識別機構的觀點提供了重要的證據。而我們對LRR結構域的分子模擬分析提示該區域是整個NALP3分子中保守性最高的部分，特殊的電荷分布使其易于通過電荷相互作用與其它分子相結合。LRR結構域的多個糖基化位點和磷酸化位點提示某種調節機制的存在。NALP3-LRR結構域和TLR胞外段能與PAMPs識別的LRR結構域相似［14］，外緣為α螺旋，內緣為β折疊，兩者交替反相折疊的馬蹄形結構也易于形成口袋狀的活性中心。

NALP3-LRR結構域能識別AIBV-ORF1a蛋白，和人們長期以來認為該分子結構是細胞內PAMPs感受器的推測相符。AIBV是冠狀病毒(coronavirus)家族成員，屬于包膜型正鏈RNA病毒，ORF1a基因是冠狀病毒的保守基因。AIBV感染是對各種家禽威脅最大的呼吸系統傳染致病原。基因組數據分析顯示，SARS冠狀病毒與AIBV冠狀病毒北京分離株存在50%的同源性［15］，SARS冠狀病毒與多個AIBV病毒株存在不同程度的序列重組現象，氨基酸取代類型上也有較大的相似性［16］。科學家在研制針對SARS冠狀病毒的疫苗時都重視借鑒過往制備AIBV疫苗的經驗［17］。雖然AIBV并非人類的致病病毒，了解NALP3-LRR結構域識別AIBV病毒蛋白的意義，在于對呼吸系統有感染能力的冠狀病毒對人類的威脅越來越大，本實驗結果為探討機體識別這一類病原體并啟動固有免疫機制提供了新思路，對研究病毒性呼吸系統感染的治療和相關疫苗的制備，以及對人類抗御傳染性呼吸道致病原，提高自身抵抗力均有重要意義。

細胞周期蛋白H為單域結構，是動植物普遍存在的細胞周期蛋白，在細胞周期的各個時相均有表達，通過與CDK7結合形成CAK，促進多個CDK的磷酸化，參與細胞周期的調節。人細胞周期蛋白H能與P53蛋白直接相互作用，使之磷酸化，促進細胞增殖。至今，尚未有關于人細胞周期蛋白H直接參與固有免疫調節和炎癥反應的報道。眾所周知，增生是炎癥反應的主要病理過程之一，大量研究資料表明，炎癥反應影響細胞周期蛋白的表達［18］;使用細胞周期抑制劑能減輕炎癥性神經損傷和肺損傷;克氏錐蟲感染可刺激細胞增生，細胞周期蛋白表達上調，感染細胞呈炎癥表型［19-21］;細胞周期抑制性調節物p21也能抑制巨噬細胞生成IL-1β［22］。有報道稱NALP3的炎癥復合體機制還參與了代謝綜合癥、II型糖尿病、器官重塑性疾病如動脈粥樣硬化和慢性阻塞性肺疾病的發病過程，由此引起的細胞增殖過程異常理應有細胞周期蛋白的參與。既然人細胞周期蛋白H調節多種細胞周期蛋白的活性，其作為參與炎癥反應和固有免疫調節的可能性也是存在的。值得注意的是，細胞周期蛋白H大多定位于細胞核［23］，與本實驗NALP3-LRR蛋白定位于胞漿及膜結構有區別。NALP3可能通過對細胞周期蛋白H的識別影響其入核發揮作用，進而影響細胞增殖進程，或者細胞周期蛋白H還具有與周期調節不同的功能也是值得深入研究的新課題。例如，高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的定位和功能就主要在細胞核內，但某些組織細胞在特定情況下能主動分泌HMGB1到胞外誘發炎癥反應并能被TLR識別。本實驗室曾報道PYRIN蛋白家族成員存在較復雜的基因多態性變化［24］，深入探討NALP3-LRR與細胞周期蛋白H的相互作用將有助于闡明固有免疫和細胞增殖的關系和調節機制。

雖然我們的研究在細胞水平(包括酵母細胞和人腎上皮細胞)上證實NALP3-LRR結構域與人細胞周期蛋白H和AIBV-ORF1a蛋白存在相互作用，但實驗條件是處于體外人工轉染高表達狀態下。進一步研究在生理及病理狀態下NALP3分子與這些蛋白的相互作用將有助于闡明NALP3作為細胞內危險信號感受器的識別機制。

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