液體復蘇聯合氫氣吸入對膿毒性休克大鼠肺臟的作用*

劉 偉，孫裕強，孫 寧，劉 志

(中國醫科大學附屬第一醫院急診科，遼寧沈陽110001)

早期液體復蘇是救治膿毒性休克的重要和必要手段，雖然有臨床實驗報道早期液體復蘇能改善膿毒性休克合并急性肺損傷(acute lung injury，ALI)患者的預后［1-2］，但也有研究稱大量補液可使液體在組織間隙潴留而加重休克患者的肺損傷［3-4］。我們前期研究發現，早期液體復蘇與氫氣吸入作為聯合干預手段，可以減少復蘇所需要的液體量，減輕肺水腫和肺臟的氧化還原損傷［5］。本實驗將進一步研究這種聯合干預方法對膿毒性休克大鼠肺臟凋亡蛋白及炎癥介質表達的影響，以期為臨床應用提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 大鼠隨機分成4組，正常對照組(A組，n=15)、膿毒性休克對照組(B組，n=15)、早期液體復蘇組(C組，n=15)和早期液體復蘇+2%氫氣吸入組(D組，n=15)。所有動物均為健康雄性Wistar大鼠(180～200 g)，由中國醫科大學實驗動物部提供，并在清潔級動物房飼養繁殖。

1.2 主要儀器 HX300動物呼吸機，HP便攜式心電監護儀，OMNI血氣分析儀(瑞士 AVL公司)，Trans-Blot轉印儀 (Bio-Rad)，光學顯微鏡(Olympus)。

1.3 主要試劑 脂多糖［lipopolysaccharides，LPS;Sigma(L-2880);from E.coli serotype O55:B5］，白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、IL-8和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗鼠Fas及Bcl-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，PVDF膜 (Millipore)，ECL reagents(GE healthcare)。

2 方法

2.1 動物模型制作 10%水合氯醛(300 mg/kg)經腹腔麻醉，氣管切開接呼吸機輔助通氣，呼吸頻率100 min－1，潮氣量10 mL/kg，D組吸入氣體為2%氫空混合氣，其余3組吸入氣體為空氣。左頸動脈穿刺，連接監護儀監測心率及平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP);股靜脈穿刺留置導管，以備給藥及補液，電熱器維持體溫。大鼠狀態穩定30 min后，除A組外，其余3組LPS 15 mg/kg(配制濃度10 g/L，推注時間不少于2 min，推注完畢再推入0.2 mL生理鹽水將注射器內殘存的LPS完全注入)緩慢靜脈注射，建立膿毒性休克大鼠模型［6］，A組靜脈注入等量生理鹽水。液體復蘇方案:生理鹽水10 mL/kg/15 min，30 min后根據MAP水平，應用去甲腎上腺素(0.5 ～ 6 μg·kg－1·min－1)，維持 MAP 于正常水平［6］。記錄各組的生命體征、補液量及去甲腎上腺素的用量。

所有大鼠于模型建立成功2 h后經頸動脈放血處死，留取動脈血1 mL行血氣分析;開胸取出心肺，剪下右肺背后葉，切取0.1 cm ×0.1 cm ×0.1 cm 組織多塊，一塊4℃ 4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片，留作HE染色及免疫組化，一塊－70℃保存，留作Western blotting測定;右肺門結扎，用2 mL生理鹽水對左肺進行反復肺泡灌洗3次，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收量 3.0～3.6 mL，將 BALF 離心(1 500 ×g、4 min)，上清液－20℃保存，留作檢測炎癥介質表達。

2.2 免疫組化檢測肺臟組織中Fas及Bcl-2表達所有標本均經40 g/L甲醛固定，石蠟包埋組織連續切片(厚4 μm)，每例標本分別做常規HE和免疫組織化學染色。免疫組織化學SP法分別標記Fas及Bcl-2，操作步驟按說明書進行。DAB顯色，蘇木素復染核。PBS代替第I抗體作為陰性對照，光學顯微鏡下觀察結果。

2.3 Western blotting檢測肺組織中Fas及Bcl-2蛋白表達 每組蛋白上樣量均為10 μg，采 12.5%SDS-PAGE膠進行電泳，采用Trans-Blot轉印儀，將蛋白轉印至PVDF膜，然后加入相抗體，通過ECL試劑檢測抗原抗體復合物。采用Quantity One軟件進行條帶分析。

2.4 BALF中炎癥介質檢測 將凍存的BALF在冰上解凍，1 000×g 4℃離心15 min，ELISA檢測IL-6、IL-8和TNF-α水平(嚴格按說明書操作)。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織HE染色結果

光鏡下觀察HE染色肺組織切片，A組肺泡結構完整，未見明顯充血、中性粒細胞侵潤和間質水腫，見圖1A;B組肺泡結構紊亂，肺泡壁完整性破壞，伴有肺泡壁增厚、水腫，肺泡腔內大量中性粒細胞聚集，肺泡毛細血管充血滲出，肺泡腔內出血，部分肺泡萎陷，見圖1B;C組肺泡腔內中性粒細胞聚集較B組明顯減少，肺泡毛細血管滲出亦有所減輕，但肺泡壁水腫未見明顯改善，見圖1C;D組肺泡損傷情況較B組明顯減輕，肺泡壁充血水腫較C組明顯緩解，見圖1D。

Figure 1.HE staining of pulmoary tissues in A，B，C and D groups(×200).圖1 肺組織病理變化

2 肺組織中Fas及Bcl-2免疫組化表達結果

免疫組化染色檢測Fas及Bcl-2表達，2種蛋白表達陽性反應物質呈棕黃色，主要位于細胞漿中，陽性表達細胞為支氣管黏膜上皮細胞、肺泡上皮細胞和炎癥細胞，正常肺組織各蛋白均有基礎低表達，見圖2。B組Fas表達增強，Bcl-2表達減弱;C組與B組比較，Fas表達減弱，Bcl-2表達增強(P＜0.05);D組與C組比較，Fas表達進一步減弱，Bcl-2表達進一步增強(P ＜0.05)，見表1。

Figure 2.Expression of Fas and Bcl-2 in pulmonary tissues in A，B，C and D groups(immunohistochemical staining，×400).圖2 免疫組織化學檢測肺組織Fas及Bcl-2的表達

表1 各組間Fas及Bcl-2平均吸光度和陽性面積率比較Table 1.The absorbance and positive rates of area of Fas and Bcl-2 in different groups(mean±SD.n=15)

3 Western blotting檢測肺組織中Fas及Bcl-2蛋白的表達

正常肺組織各蛋白均有基礎低表達，與A組相比，B組Fas表達明顯上調(P＜0.01)，Bcl-2表達明顯減弱(P＜0.01);C組與B組比較，Fas表達明顯減弱(P＜0.01)，Bcl-2表達明顯增強(P＜0.05);D組與C組比較，Fas表達明顯減弱(P＜0.05)，Bcl-2表達明顯增強(P＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Western blotting results of Fas and Bcl-2 expression in pulmonary tissues in A，B，C and D groups.Mean ± SD.n=15.＊＊P ＜0.01 vs A group;△△P ＜0.01 vs B group;#P ＜0.05 vs C group.圖3 Western blotting檢測肺組織Fas及Bcl-2蛋白的表達

4 BALF中炎癥介質表達

B組BALF中 IL-6、IL-8、TNF-α水平較 A 組明顯升高(P＜0.05);C組與B組比較促炎介質水平降低(P＜0.05);D組與C組比較進一步降低了促炎介質水平(P ＜0.05)，見表2。

表2 各組BALF中炎性介質的水平Table 2.Levels of inflammatory mediators in BALF(ng/L.Mean±SD.n=15)

討 論

膿毒性休克和急性肺損傷是危重癥患者的主要死亡原因，失控和放大的炎癥反應是膿毒癥和ALI的重要發病機制之一［7］，本研究結果顯示膿毒性休克導致ALI過程中肺泡灌洗液中促炎介質IL-6、IL-8、TNF-α水平較正常對照組明顯升高。

一直以來氫分子被認為是一種惰性氣體，在潛水醫學領域高壓氫被作為一種潛水技術。但最近研究證實低濃度氫可以選擇性中和羥自由基，而后者是氧化損傷的最重要介質，目前體內尚未找到特異性清除途徑，動物呼吸2%的氫氣就可有效清除自由基，顯著改善腦缺血－再灌注損傷［8］，隨后多項研究證實在缺血－再灌注損傷、炎性疾病、代謝性疾病、神經性疾病等動物模型中，氫分子都顯示了較好的治療效果［9-12］。目前氫分子在膿毒癥領域研究甚少，我們前期研究發現，早期液體復蘇與氫氣吸入作為聯合干預手段，可以減少復蘇所需要的液體量，減輕肺水腫和肺臟的氧化還原損傷［5］。本實驗結果進一步提示聯合氫氣吸入的液體復蘇方案比單純液體復蘇更能降低肺泡灌洗液中促炎介質(IL-6、IL-8和TNF-α)表達水平，從而從減輕過度炎癥反應導致的肺損傷方面保護肺功能。

肺泡上皮細胞凋亡是ALI發生發展的重要機制［13］。肺泡上皮一旦受損，就會出現跨上皮液體運輸及肺泡水腫液再吸收障礙，液體平衡將會迅速遭到破壞，導致肺水腫及肺功能障礙［14-15］。研究發現，死亡受體通路中Fas-FasL與ALI/ARDS肺泡上皮細胞凋亡關系密切。內毒素誘發肺損傷時，肺內上皮細胞Fas表達增加，阻斷Fas系統可減輕內毒素引發的肺損傷［16］。Bcl-2被認為是最重要的抗凋亡因子，能抑制許多因素誘發的細胞凋亡，是細胞存活、凋亡和壞死的關鍵調控因子，是公認的細胞保護因子［17-18］。本實驗結果顯示膿毒性休克對照組肺組織中Fas表達增加而Bcl-2表達減少，提示Fas和Bcl-2參與了膿毒性休克致ALI中肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞的凋亡，導致了ALI的發生及發展。單純液體復蘇使肺臟細胞凋亡程度下降，表現為Fas表達減少而Bcl-2表達升高，聯合氫氣吸入后上述凋亡情況進一步改善，提示氫氣吸入可以降低肺組織中Fas表達、提高Bcl-2表達，從而減輕了肺組織細胞凋亡程度，抑制凋亡所致急性肺損傷，進一步保護肺功能。

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