shRNA介導的hWAPL表達沉默對人宮頸癌CaSki細胞增殖與凋亡的影響*

潘巍巍， 徐 營， 曹利仙， 沈忠飛， 郭連軍， 宋方洲△

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤，發病率逐年升高，并且呈現年輕化的趨勢。因此，研究預防治療宮頸癌的方法已成為人們關注和研究的熱點［1-2］。近年發現，人半翼(human wings apart-like，hWAPL)基因與宮頸癌及HPV關系密切［3］，是果蠅體內半翼(wings apart-like，WAPL)基因在人體內的同源序列。WAPL基因是1977年在果蠅體內發現的一個基因［4-5］，定位于果蠅的X染色體 2D4～2D5。在有絲分裂中，WAPL基因編碼的蛋白質主要功能是控制染色質結構，維持染色單體的黏合［6-7］。hWAPL長約30 793 bp，定位于10q23.2，其編碼一種聚合錨定蛋白，可以在有絲分裂前期使染色體臂的聚合適時解離［8-9］。研究證實hWAPL基因是一種宮頸癌特異性高表達基因［10-12］，其蛋白在宮頸癌的發生發展中起極其重要的作用。為進一步探討hWAPL在細胞增殖和凋亡中的作用及其作為分子靶點用于腫瘤治療的潛在價值，本研究采用RNA干擾技術抑制hWAPL的表達，在體內和體外分別觀察了其對人宮頸癌CaSki細胞增殖與凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 質粒載體pGenesil(武漢晶賽生物公司);Hind III、EcoR I、BamH I、Sal I和 T4 DNA 連接酶(大連寶生物公司);Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen);λDNA/Hind III DNA marker、DL2000 DNA marker、質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、DNA小量膠回收純化試劑盒和卡那霉素均為大連寶生物工程有限公司產品;G418(Amresco);胎牛血清(HyClone);DMEM/FI2細胞培養基(Invitrogen)，青鏈霉素(Gibco)，Hoechst 33258染色液和退火緩沖液購于碧云天生物技術研究所，DH5α由本實驗室保存，β-actin和cleaved caspase-3抗體購于Cell Signaling，hWAPL、p21 和 p27 抗體購自 Santa Cruz，免疫組化Ⅱ抗購自Molecular Probes，Ⅲ抗ABC kit和DAB顯色液購自Vector Laboratories，逆轉錄試劑盒購于Bio-Rad，Annexin V-PE試劑盒購自BD。

1.2 細胞培養 CaSki細胞(重慶醫科大學提供)以含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養基，在37℃、5%CO2條件下培養。0.25%EDTA胰酶消化細胞，2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞實驗。

1.3 裸鼠 6～8周齡BALB/c裸鼠購自上海斯萊克。裸鼠飼養在重慶醫科大學實驗動物中心，SPF級。

2 方法

2.1 pGenesil-1-hWAPL-shRNA穩定表達的CaSki細胞系的篩選 hWAPL基因的shRNA序列設計及連接參照文獻［13］。CaSki細胞培養于DMEM/F12培養基，含10%胎牛血清，37℃、5%CO2孵箱中過夜，待細胞匯合度約80%～90%時給細胞換成無血清培養液，使用Lipofectamine 2000將構建好的pGenesil空載體和pGenesil-hWAPL-shRNA質粒轉染到CaSki細胞。轉染8 h后給細胞換成正常培養液。24 h后給細胞加入G418(200 mg/L)篩選10～14 d，獲得穩定表達的細胞系。

2.2 實時熒光定量PCR pGenesil空載體和pGenesil-hWAPL-shRNA轉染CaSki細胞培養24 h后，Trizol提取細胞總RNA.將提取的總RNA(5 μg)按照說明逆轉錄成 cDNA。hWAPL上游引物5’-CCTTAGCCGTGACAGAAC-3’，下游引物 5’-GGAATCGGCACTGTCTTG-3’，產物片段為246 bp;β-actin上游引物 5’-GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT-3’，下游引物5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’，產物片段為279 bp。定量PCR步驟:95℃變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃ 32 s，30 個循環，72 ℃延伸 10 min。數據使用Q-RT_Analysis分析軟件處理，使用Graph-Pad Prism 5軟件作圖。

2.3 MTT檢測細胞增殖 將3×103個穩定表達空載體和pGenesil-hWAPL-shRNA的CaSki細胞接種于96孔板中，同時設空白對照。細胞培養72 h后加入20 μL MTT(5 g/L)，4 ～ 6 h 后加 DMSO(150 μL/well)，振蕩10 s，490 nm檢測。每組設3個復孔，實驗重復3次。

2.4 Annexin V-PE染色檢測細胞凋亡 收集細胞106，預冷1×PBS洗滌2次，1× binding buffer重懸細胞，取105個細胞放置到5 mL離心管中，分別加入5 μL Annexin V-PE 和 5 μL 7-氨基放線菌素(7-aminoactinomycin，7-AAD)混懸細胞，混勻、室溫避光放置15 min，加400 μL 1 ×binding buffer應用流式細胞術檢測細胞凋亡。

2.5 Hoechst 33258熒光染色檢測細胞凋亡 將CaSki細胞接種于24孔板過夜(細胞爬片生長)，分別向 CaSki細胞轉染 pGenesil-hWAPL-shRNA和pGenesil-shCON，24 h后PBS洗細胞3次，加入1 mL Hoechst 33258染色液，室溫放置5 min，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗3次，每次5 min。封片后熒光顯微鏡下觀察。

2.6 裸鼠荷瘤模型 6～8周齡的雌性裸鼠5只SPF級飼養，無菌的條件下給每只裸鼠的兩側背部皮下分別注射1×106個作為對照的(shCON)CaSki細胞(左側背部皮下)和穩定表達hWAPL-shRNA的CaSki細胞(右側背部皮下)，待30 d后裸鼠成瘤，取出腫瘤組織中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片(5 μm)，行HE染色。

2.7 免疫組化 石蠟切片經二甲苯、乙醇脫蠟3次，每次 3 min，水化，3%H2O2避光10 min，0.02 mol/L枸櫞酸鈉抗原修復，95℃ 15 min，10%山羊血清封閉30 min，Ⅰ抗(1∶200)室溫1 h，1×PBST洗3遍，每次3 min，Ⅱ抗室溫30 min，1×PBST洗3次，每次3 min，Ⅲ抗室溫30 min，1×PBST洗3次，每次3 min。DAB顯色，終止，逐級脫水，中性樹脂封片。

2.8 蛋白質印跡分析 吸去培養瓶中的培養基，1×PBS將細胞洗滌2次，收集細胞，提取細胞總蛋白，取100 μg總蛋白做 SDS-PAGE，轉至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，1×TBST洗3次，每次8 min，分 別 與 內參 照 β-actin、cleaved caspase-3、hWAPL、p21和p27抗體(均1∶1 000)4℃孵育過夜，1×PBST洗膜3次，每次8 min。Ⅱ抗孵育，洗膜3次，每次8 min，雜交反應后應用ECL Western blotting化學發光試劑盒暗房顯影。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 hWAPL-shRNA在CaSki細胞中干擾效率的檢測

pGenesil載體帶有EGFP，熒光顯微鏡下可看見綠色熒光蛋白表達。G418篩選轉染pGenesil-hWAPL-shRNA和pGenesil-shCON的CaSki細胞10～14 d后獲得穩定表達shCON和hWAPL-shRNA的細胞系，熒光顯微鏡下可見強的綠色熒光表達，見圖1A。實時熒光定量PCR檢測發現hWAPL mRNA表達量明顯減少，與對照相比只有10%左右，見圖1B。Western blotting檢測發現干擾后hWAPL蛋白表達也明顯減少，見圖1C。

2 hWAPL基因沉默抑制CaSki細胞生長

RNA干擾hWAPL 72 h后，顯微鏡下觀察可見RNA干擾組CaSki細胞的數目與對照組相比明顯減少，見圖2A。MTT結果同樣顯示hWAPL基因沉默組細胞增殖與對照組相比明顯減少，差異具有統計學意義(P ＜0.05)，見圖2B。

Figure 1.Interference efficiency of hWAPL-shRNA in CaSki cells.A:EGFP expression observed by fluorescence microscopy(×200).B:hWAPL mRNA expression detected by real-time fluorescence quantitative PCR;C:hWAPL protein expression detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖1 CaSki細胞中hWAPL shRNA干擾效率的檢測

Figure 2.hWAPL silencing inhibited CaSki cell proliferation.A:numbers of the cells cultured in 6-well plates for 72 h were observed under contrast-phase microscope(×200).B:MTT assay results.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs shCON.圖2 hWAPL沉默抑制CaSki細胞增殖

3 沉默hWAPL基因增加CaSki細胞凋亡

流式細胞術檢測顯示，對照組細胞凋亡率為1.4%，RNA干擾hWAPL后CaSki細胞凋亡率明顯增加到17.8%，見圖3A，這表明 hWAPL沉默增加了CaSki細胞凋亡。Hoechst 33258染色表明對照組(shCON)細胞發生染色質凝集、邊緣化的細胞數目明顯少于干擾組(hWAPL-shRNA)，干擾組部分細胞細胞核出現染色質高度凝集、邊緣化、核固縮等凋亡的特征，熒光顯微鏡下可見細胞核呈現強烈的藍色熒光，見圖3B。上述結果表明hWAPL沉默促進CaS-ki細胞發生凋亡。

4 沉默hWAPL基因降低CaSki細胞的成瘤能力

為了在體內進一步驗證hWAPL基因的作用，我們分別給裸鼠背部皮下注射含有shCON和hWAPL-shRNA的CaSki細胞，30 d后待裸鼠成瘤取出腫瘤組織稱重，對照組的腫瘤明顯大于RNA干擾組，見圖4A。腫瘤組織HE染色顯微鏡觀察可見增殖旺盛的腫瘤細胞，見圖4C。免疫組化檢測RNA干擾組腫瘤組織中hWAPL表達明顯減少，而對照組hWAPL表達較高，見圖4C。RNA干擾組腫瘤組織中增殖細胞核抗原(proliferative cell nuclear antigaen，PCNA)明顯少于對照組，這表明在裸鼠體內hWAPL沉默腫瘤細胞增殖減弱，見圖4C。該實驗在動物體內進一步驗證了hWAPL沉默明顯降低CaSki細胞的成瘤能力。

Figure 3.hWAPL silencing promoted CaSki cell apoptosis.A:flow cytometry results;B:Hoechst 33258 staining results(×400).Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖3 hWAPL沉默促進CaSki細胞凋亡

5 蛋白質印跡分析凋亡相關蛋白

hWAPL RNA干擾組細胞中，cleaved caspase-3和細胞周期相關蛋白p21、p27的表達均上調，見圖5。這表明hWAPL沉默誘發的細胞凋亡與細胞周期抑制蛋白的高表達有關。

討 論

細胞凋亡是由多種基因控制的自主性的程序化死亡過程［13］。凋亡在機體的生長發育、細胞分化、病理狀態和細胞清除等方面具有十分重要的意義。而腫瘤細胞的發生多存在不同程度的細胞凋亡過程的異常，是細胞增殖和凋亡調控異常導致平衡失調的綜合性結果，因此深入研究腫瘤的凋亡過程對腫瘤的治療有著重要的意義。

Figure 4.Tumorigenic capacity of CaSki cells with hWAPL silencing in nude mice.CaSki cells transfected with shCON and hWAPL-shRNA(1×106cells for each)were subcutaneously implanted into the left and right flanks of nude mice，respectively.After 30 days，the tumors were removed.A:tumor size measurement;B:tumor weighing results;C:HE staining of tumor tissues and immunohistochemical staining for hWAPL and PCNA expression in tumor tissues(×200).Mean±SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖4 在裸鼠體內hWAPL影響細胞增殖

Figure 5.Western blotting analysis of the protein expression of cleaved caspase-3，p27 and p21 in CaSki cells.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs shCON.圖5 Western blotting檢測凋亡及細胞周期抑制相關蛋白

本實驗采用RNA干擾技術，研究hWAPL基因沉默后對人宮頸癌CaSki細胞增殖和凋亡的影響。在前期研究中我們成功構建針對hWAPL基因的shRNA真核表達載體。經酶切和測序鑒定表明成功構建了 3 個 pGenesil-hWAPL-shRNA［14-15］，采用脂質體法轉染CaSki細胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達，表明裝載到質粒上的基因片段通過脂質體的介導成功轉染到細胞內并高表達EGFP，實時定量PCR和Western blotting檢測結果表明，構建的pGenesil-hWAPL-shRNA能夠有效抑制內源hWAPL表達。我們通過Annexin V-PE和Hoechst 33258染色方法檢測發現shRNA介導的hWAPL表達沉默促進了CaSki細胞的凋亡，Western blotting檢測發現cleaved caspase-3表達明顯增加。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中導致細胞凋亡的最強大的最終效應因子，受多種信號轉導通路的調控，caspase-3被激活后，作用于細胞質成分，而使細胞發生凋亡［16］。

p27基因是一種調控細胞周期并抑制細胞分裂的重要基因，其蛋白可直接抑制cyclin-CDK復合物的生物學活性，使細胞停滯于G期，同時具有促進細胞分化、介導細胞間黏附及誘導凋亡等功能，其蛋白表達異常導致細胞增殖與凋亡失衡，促進腫瘤的發生和發展［17］。p21蛋白可以與cyclin和CDK結合，從而抑制cyclin-CDK復合物的激酶活性，抑制Rb蛋白磷酸化，使細胞停滯于G期，不能進入S期，起到細胞周期調控作用［18］。hWAPL基因沉默增加了細胞周期抑制蛋白p21和p27的表達，從而抑制CaSki細胞增殖導致細胞凋亡增加。因此，以hWAPL為靶點的治療很可能同時具有抑制細胞增殖、誘發細胞凋亡和提高化療藥物敏感性的多重效應。

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