黑視素基因轉染給光雙極細胞部分恢復MNU誘導的視網膜感光細胞變性小鼠的視覺*

熊國吟， 羅小鵬， 楊昇炎， 徐 穎， 董 軍△

視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種眼科常見的遺傳性疾病。全球發病率約在1/3 500［1］。其病理過程為視網膜感光細胞逐漸凋亡，最終導致中心視力的全部喪失。其視網膜電圖(electroretinogram，ERG)a波和b波波形減弱甚至熄滅，視覺眼電圖(electro-oculogram，EOG)波形光峰值和暗谷值均減小，甚至呈平坦型。眼底可觀察到骨細胞樣色素沉積。RP的遺傳方式多樣，單基因遺傳占大多數。目前尚無長期有效的預防和治愈RP的方法。大多數患者RP的發生是由于單個基因發生變異，從而引起相應蛋白無法合成，進而影響感光細胞的發育或正常結構與功能維持。而轉入相應正?；騽t很有可能挽救因基因變異導致凋亡的感光細胞，甚至使其恢復正常水平。目前已有大量相關研究均成功地將正?；驅攵喾NRP動物模型［2］。臨床實驗也證明了其有效性和安全性［3］。然而常規基因治療的缺陷在于必須針對患者缺陷基因和患者自身條件選擇載體并設計治療方案，其效率底、成本高。

近年來隨著光感受蛋白的發現，一種新的基因治療概念被提出:將光感受蛋白基因轉導入發生退行性變視網膜的神經元中，使其直接對光照產生反應，從而恢復視覺［4］。研究表明，將一種外源性光感受蛋白——視紫質通道蛋白(channelrhodopsin-2，ChR2)基因定向轉染進入視網膜變性模型rd1小鼠視網膜給光型雙極細胞，在較強光刺激下可以觀察到動物視覺的恢復［5］。有研究者將光敏感度高的內源性光感受蛋白黑視素(melanopsin/opsin 4，Opn4)表達至rd1小鼠視網膜神經節細胞中，恢復了動物部分視力［6］。而將黑視素基因轉導于節細胞上級神經元(如雙極細胞)尚未見報道。

黑視素蛋白是一種內源性光感受蛋白，約0.8%～1.0% 的視網膜神經節細胞含有黑視素［7］。黑視素參與晝夜節律［8］、瞳孔對光反射［9］等行為。黑視素蛋白不僅對光反應迅速，也由于其內源性的特點在體內長期表達不會引起免疫負反應。而將給光雙極細胞作為靶點可以使動物區分給光/撤光通路，恢復較為高級視覺行為;此外給光雙極細胞內部含有的多種G蛋白調節因子(regulators of G-protein signaling，RGS;如 RGS7和 RGS20)、浦肯野細胞蛋白 2(Purkinje cell protein 2，PCP2)等，均可參與加速細胞的光反應［10］。因此，本研究將選取甲基亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)誘導的CD1小鼠作為視網膜色素變性模型，定向轉導黑視素基因于其視網膜給光型雙極細胞，以期恢復動物視覺行為。

材料和方法

1 動物

CD1小鼠購于廣東省醫學實驗動物中心(合格證號為SCXK粵，2008-0002)。2雌1雄配種合籠飼養，不限食水，飼養溫度保持在23～26℃，嚴格遵循12 h晝/夜節律，使用內部空氣循環系統。動物實驗操作過程嚴格遵從暨南大學醫學院實驗動物使用條例。

2 主要材料

質粒Grm6-Opn4-GFP和Grm6-GFP均由美國賓夕法尼亞大學神經科學系視網膜研究室提供。構建出的質粒已通過基因測序檢測。其中Grm6為給光雙極細胞特異性受體——代謝型谷氨酸受體 6(metabotropic glutamate receptor 6，mGluR6)的啟動子;Opn4為黑視素基因序列;GFP為綠色熒光蛋白基因序列。

MNU購于Sigma，實驗時用生理鹽水(normal saline，NS)配制為1% 溶液。由于MNU商品中含有少量醋酸，在終溶液中含量為 0.1%，故配制含有0.1% 醋酸的NS溶液作為對照組注射用液。

3 方法

3.1 MNU誘導的視網膜色素變性模型的建立 取成年CD1小鼠，于腹腔注射1%MNU，60 mg/kg(體重)。于第7天處死動物，取眼球制冰凍切片。切片經DAPI染色顯示由MNU誘導7 d后小鼠視網膜感光細胞完全死亡，外核層消失，內核層(雙極細胞、無長突細胞、水平細胞)及節細胞層完好，證明CD1小鼠腹腔注射MNU可形成迅速穩定的視網膜色素變性模型，見圖1。

Figure 1.The retinal slices of normal(A)and MNU-induced CD1 mice at 7 d(B).The MNU-induced mouse lost the whole outer nuclear layer(ONL)，while the inner nuclear layer(INL)and retinal ganglion cell layer(GCL)remained，suggesting that MNU could induce a model of RP.PE:pigment epithelium.Scale bar=20 μm.圖1 正常和MNU誘導7 d的CD1小鼠的視網膜切片

3.2 乳鼠眼底注射質粒并電轉 用生理鹽水將目的質粒稀釋至3 g/L，加入0.1%Fast green染料。Fast green是一種安全無毒的深綠色染色劑，用于評價眼底注射手術情況。取P0～P1乳鼠，隨機分為治療組(Grm6-Opn4-GFP)和陰性對照組(Grm6-GFP)。在手術顯微鏡下用注射器針頭(0.5 mL)劃開動物右眼眼瞼并突出眼球，于眼球鼻側角鞏緣下方開口。微量注射器針尖由此開口進入眼球，迅速將0.5 μL質粒溶液注入乳鼠視網膜下腔。術后乳鼠立刻利用電轉電融合儀(BEX-CUY21VIVO-SQ)進行眼部電轉，手術眼為正極，對照眼為負極。電轉參數設置:電壓80 V，刺激時長50 ms，間隔時間950 ms，連續刺激5次。

3.3 行為學檢測 動物行為學檢測采用明暗箱測試，規格為16×16×25+16×16×25(長×寬×高;單位:cm)，箱體間有門可供動物自由穿梭。2個箱頂均設有攝像頭對動物運動軌跡進行追蹤，并由動物行為軌跡分析系統(Noldus-EthoVision XT 7.0)進行分析。測試時長為5 min。共設計5個實驗組:正常對照組(normal)、生理鹽水Grm6-Opn4-GFP對照組(NS+melanopsin)、MNU誘導模型 Grm6-Opn4-GFP治療組(MNU+melanopsin)、MNU誘導模型Grm6-GFP對照組(MNU+GFP)和 MNU誘導組(MNU)。誘導后連續7 d進行明暗箱測試。記錄動物在儀器中運動軌跡，并計算第7天動物在暗箱中活動時間占總時長的百分比。

3.4 電眼生理系統檢測ERG 動物于全暗條件下進行12 h暗適應，實驗前6 h禁食禁水。檢測前于暗紅燈光下用3.5%水合氯醛對動物進行麻醉(12.5 μL/g體重)。待動物全麻后于其雙眼眼表滴加復方托吡卡胺滴眼液散瞳。將動物放于活動搭載臺上并連接電極。活動電極采用3 mm環形角膜接觸電極，參考電極為不銹鋼針電極，插于雙耳耳后皮下，接地電極插于尾根皮下。散瞳完畢，于動物雙眼各滴加10 g/L甲基纖維素溶液，可降低阻抗，保持眼球濕潤。待參考電極阻抗穩定在2.3 kΩ以下，活動電極阻抗保持在7 kΩ以下，關閉所有光源給予動物5 min暗適應。實驗中給予 Scotopic 0.003、0.03、0.3、1、3和10 cd·s/m2一系列刺激，經5 min強度為20 cd/m2的綠色背景光明適應后，再給予Photopic 0.3、1、3、10 和30 cd·s/m2刺激。刺激強度不高于 3.0 cd·s/m2時刺激光均為綠光，高于3.0 cd·s/m2時則為白光。刺激次數及間隔時間根據刺激光強分別為3～10次和2～10 s之間。用Clampfit 9.2軟件對數據進行分析。從測試系統導出原始數據后，濾去50 Hz波，測量計算波形中主要反映給光雙極細胞光反應的b波振幅及潛伏期并進行統計。

3.5 質粒轉染效果的鑒定 取不低于5周齡的動物，用3.5%水合氯醛腹腔過量注射對其進行麻醉(20 μL/g)處死后全身灌流。待動物全身僵直灌注成功后，取出其右眼眼球，置于4%多聚甲醛中固定30 min。隨后剝離視網膜，將視網膜平鋪片，在熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達并拍照。用共聚焦顯微鏡對轉染成功的視網膜平鋪片拍照并進行三維重建。40倍油鏡，光切厚度為1.5 μm。重建時統一將立體圖像沿Z軸旋轉，通過雙極細胞特有形態辨認轉染成功的細胞。最后進行黑視素抗體免疫熒光檢驗并將視網膜進行震動切片(50 μm)。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件分析。數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，使用SPSS 13.0統計軟件進行分析，單因素分析檢驗組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 黑視素可以定向表達于給光雙極細胞

1.1 質粒定向轉染進入給光型雙極細胞 正常小鼠視網膜發育在5周時達到成熟，故選擇5周以上的小鼠能夠準確地反映視網膜發育、變性以及目的基因治療的狀況。首先取小鼠經質粒轉染的右眼視網膜進行平鋪片，在熒光顯微鏡下觀察。觀察到視網膜局部存在密集綠色熒光蛋白即可初步認定質粒轉染成功，見圖2A、B。將平鋪片共聚焦斷層掃描結果經Z軸旋轉可清晰看到所有被綠色熒光標記的細胞都具有典型的給光型雙極細胞形態，包括胞體兩側的樹突、軸突以及分支在給光層的軸突末端，見圖2C、D。

1.2 轉染Grm6-Opn4-GFP的細胞表達黑視素蛋白

隨后進行視網膜平鋪片的黑視素抗體免疫熒光染色，以檢驗黑視素蛋白的表達。視網膜平鋪片顯示所有被綠色熒光標記的細胞都被黑視素抗體標記;對照質粒Grm6-GFP轉染的細胞未被黑視素抗體標記，見圖3。因此，電轉染技術可以使黑視素蛋白特異地表達于給光型雙極細胞。

Figure 2.Grm6-Opn4-GFP plasmid was specifically transfected into ON-bipolar cells.A:the whole-mount retina showing successful transfection;B:enlarged image of the box region in A;C:confocal microscopy of the transfected region;D:the 3D reconstruction in Z axis.The solid arrows show the dendrites of the bipolar cells and the dotted arrow shows the axon of the bipolar cells.The solid lines in D show the inner plexiform layer(IPL)of retina，and the dashed line divides the ON and OFF sublayers.All transfected bipolar cells have axon terminals in the ON sublayer.Scale bars:200 μm(A)，20 μm(B)and 100 μm(C，D).圖2 質粒轉染效率檢查表明質粒能夠定向表達于給光型雙極細胞

Figure 3.Anti-melanopsin test on whole-mount retina(MNU-induced)transfected with Grm6-Opn4-GFP and Grm6-GFP plasmids.圖3 Grm6-Opn4-GFP和Grm6-GFP質粒轉染成功的小鼠視網膜平鋪片上黑視素蛋白的表達

2 行為學檢測(明暗箱測試)表明黑視素治療小鼠的趨暗視覺行為有所恢復

小鼠為夜行性哺乳動物，其活動具有趨小、趨暗的特點。視覺能力正常的小鼠在除光亮度外其余條件均一致的明暗箱中自由活動時，對暗箱表現出明顯的趨向性，見圖4C;而完全失明的小鼠由于無法區分明暗，不表現出任何趨向性。因此，通過比較小鼠在暗箱的活動時間比，可以作為檢測小鼠視覺行為的手段。MNU誘導的CD1模型組動物連續7 d的測試顯示，經MNU誘導的小鼠視覺行為能力在注射后7 d內迅速下降，于7 d呈完全失明狀態，這點與7 d后視網膜感光細胞完全消失相對應，見圖4D。而經Grm6-Opn4-GFP轉導的MNU模型小鼠則表現出一定程度的恢復趨勢，在黑箱的活動時間顯著長于未治療組(P＜0.05)，見圖4B、E;但未能達到正常組和生理鹽水對照組水平(P＜0.05)，見圖4A、C。這表明黑視素蛋白表達可以提高動物的基本視覺能力。

3 電眼生理系統檢測表明黑視素治療小鼠的ERG b波有所恢復

閃光視網膜電圖(flash ERG)波形主體通常由1個向下的負波和緊隨其后1個向上的正波構成。向下的負波被稱為a波，其振幅及潛伏期反映了感光細胞的光反應情況;a波之后迅速向上的正波被稱為b波，反映的是給光型雙極細胞和無長突細胞的光反應，也是本文重點關注的部分。在明適應條件下，b波之后還可能會出現一個向下的負波，被稱為明視負波反應(photopic negative response，PhNR)，主要反映神經節細胞的光反應。正常小鼠感光細胞正常，flash ERG測試可以獲得清晰的a波、b波和PhNR，見圖5A。然而視網膜色素變性由于其感光細胞受損，將無法檢測到任何波型。本實驗預期受質粒轉染并表達黑視素蛋白的給光型雙極細胞可以直接對光產生反應后形成電信號，恢復b波，進而將信號傳導至神經節細胞，恢復PhNR。

Figure 4.Transfecting melanopsin partially restored the visual behavior of MNU-induced retinitis pigmentosa mice.The running traces of CD1 mice in dark zones(left)and light zones(right)were shown.Mean±SEM.n≥10.☆P ＜0.05，☆☆P ＜ 0.01 vs NS+melanopsin control;★P ＜0.05 vs MNU group or MNU+GFP group.圖4 轉染黑視素基因可以使MNU誘導的視網膜色素變性小鼠恢復部分視力

視網膜電圖測試顯示，隨著閃光強度的增加，正常小鼠的a、b波幅度增強，潛伏期縮短;MNU誘導視網膜變性的小鼠ERG波形完全消失;經Grm6-Opn4-GFP質粒轉染的MNU誘導的CD1小鼠在閃光刺激強度增高至1 cd·s/m2時，b波有局部恢復，見圖5B。經統計分析表明，治療組b波振幅與未治療組相比有顯著差異(P＜0.01)，表明動物視覺反應得到了一定恢復，但尚未能達到正常水平(約正常水平的10%)，其潛伏期也有所推遲，見圖5C、D。但是，在明適應條件下，治療組未發現具有b波恢復的趨勢，也未觀察到反應神經節細胞活動的PhNR。

討 論

本實驗利用給光型雙極細胞特異性受體mGluR6編碼序列作為啟動子，下游接目的基因黑視素及用于標記的綠色熒光蛋白序列，利用在體電轉技術，使黑視素和綠色熒光蛋白在給光雙極細胞中定向表達。電轉技術是一項廣泛應用的分子生物技術，其作用是將外源物質如藥物、小片段DNA等轉入目的受體中，病毒、真菌、離體培養的細胞和組織、在體動物細胞均可作為受體，具有高效、穩定等特點。

MNU屬于亞硝酰胺類亞硝基化合物，是一種廣泛分布于環境中的強烷化劑，對動植物具有強有力的致突變、致畸形和致癌作用。單次腹腔注射一定劑量MNU可迅速誘導視網膜感光細胞凋亡。其作用機理是MNU對感光細胞DNA產生烷化作用，生成7-甲基脫氧尿苷DNA嵌合物［11］，從而破壞 DNA的結構，引起視網膜感光細胞的不可逆性凋亡。該過程伴有 Bcl-2下調、Bax上調［12］和 caspase-3、－6、－8通路的激活。此外，MNU誘導的RP模型適用于成年小鼠和大鼠，可重復性高，1周之內即可形成穩定的RP模型，在RP的實驗研究中得到廣泛應用。

本實驗已經成功的將目的基因通過質粒載體利用電轉染技術轉導至MNU誘導的RP動物視網膜神經元中，并在給光雙極細胞中定向表達。ERG測試顯示經Grm6-Opn4-GFP轉導的RP模型組在1～10 cd·s/m2光強部分恢復了b波，說明被轉導的給光雙極細胞能直接對光產生反應。明暗箱測試顯示動物行為能力有明顯恢復說明給光雙極細胞將光反應信號轉化為電信號，并通過視網膜神經元回路對信號進行加工，傳遞至視網膜神經節細胞，信號在節細胞處形成動作電位，經視神經傳遞至視皮層形成視覺，促使動物表現出明顯的趨暗特性。

Figure 5.Transfecting melanopsin partially restored ERG responses in retinitis pigmentosa mice.A:a-wave，b-wave and PhNR of ERG responses in a normal mouse;B:the scotopic ERG waves in CD1 mice of various groups in response to flashes at increasing intensity;C:the amplitude of b-wave in CD1 mice of various groups;D:the latency of b-wave in CD1 mice of various groups.Mean ±SEM.n≥10.＊＊P ＜0.01 vs MNU group or MNU+GFP group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs NS+melanopsin group.圖5 黑視素基因轉染的視網膜色素變性小鼠ERG測試中b波有部分恢復

ERG測試中，經Grm6-Opn4-GFP轉導的模型組沒有記錄到反應神經節細胞光反應活動的PhNR?，F分析原因如下:雙極細胞根據與視錐細胞和視桿細胞的聯系分為視桿－雙極細胞和視錐－雙極細胞。視桿－雙極細胞均為給光型，大約占全部給光型雙極細胞的43%［13］;視錐－雙極細胞在小鼠視網膜中共有9種亞型，而其中的5種為給光型［14］。即給光型雙極細胞由全部的視桿－雙極細胞和部分視錐－雙極細胞構成。在明適應條件下，動物的視覺行為是由視錐細胞來完成的，相應的視錐－雙極細胞對明適應視覺行為的參與應該多過于視桿－雙極細胞，視網膜神經節細胞更多地接收來自視錐－雙極細胞發出的信號。如果視桿－雙極細胞的活動受到抑制，則發揮作用的給光型雙極細胞數量會明顯減小。由此可見，本實驗中治療模型組動物在明適應視網膜電圖中未能表現出b波的恢復以及明視負波的反應，可能由于明適應條件下，轉染成功的視桿－雙極細胞受到了一定程度的抑制，從而減弱了整體轉染成功的雙極細胞的活動，進而影響下一級神經元神經節細胞的活動。

總而言之，利用電轉染法，以給光雙極細胞特異性受體mGluR6作為啟動子，可以將內源性光感受蛋白黑視素基因定向轉染至視網膜給光雙極細胞中表達并恢復視網膜色素變性模型動物的部分視力。

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