Graves病不同階段病程中CD3-CD19+ B細(xì)胞含量變化

梁金明 歐志蓮 陳聰 李青 劉永鵬 許琳

Graves?。℅raves disease，GD）是一種常見內(nèi)分泌異常疾病，與自身免疫性有關(guān)，在GD病程的早期或活動(dòng)期，一直被認(rèn)為是由輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）2介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，Th1和Th2細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)又相互調(diào)節(jié)或交叉調(diào)節(jié)，近幾年研究提示Th1免疫應(yīng)答占主導(dǎo)[1]，隨著治療的干預(yù)和病程的發(fā)展，在緩解期或中晚期時(shí)，若Th1/Th2細(xì)胞的平衡被破壞，機(jī)體就會(huì)處于Th1優(yōu)勢(shì)或Th2優(yōu)勢(shì)漂移狀態(tài)，造成病理性免疫反應(yīng)。國(guó)外對(duì)GD的治療主要以131I為主，國(guó)內(nèi)對(duì)GD治療以抗甲狀腺藥物（antithyroid drug，ATD）較多，但復(fù)發(fā)率高，給患者造成極大的精神負(fù)擔(dān)和嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。引起這種自身免疫反應(yīng)的因素還不清楚，病人機(jī)體的免疫應(yīng)答及甲狀腺功能的變化與機(jī)體免疫之間的關(guān)系也有待研究，而以T淋巴細(xì)胞中Th2細(xì)胞功能增強(qiáng)為主的體液免疫在GD的發(fā)病中具有非常重要的作用[2]，患者體內(nèi)存在高水平的自身抗體。體液免疫B淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志主要是白細(xì)胞抗原分化群CD3-CD19+（cluster of differentiation，CD3-CD19+），本研究通過檢測(cè)正常人群、GD初發(fā)、緩解、完全緩解及復(fù)發(fā)患者CD3-CD19+占淋巴細(xì)胞比值變化，探討GD病程不同階段的B淋巴細(xì)胞及體液免疫狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集與處理

在健康體檢者中隨機(jī)選擇22例作正常對(duì)照組（簡(jiǎn)稱正常組），根據(jù)《內(nèi)科學(xué)》第6版Graves診斷標(biāo)準(zhǔn)分初次發(fā)現(xiàn)且未治療病人33例（簡(jiǎn)稱初發(fā)組），ATD治療后緩解患者30例（TSH、TT3、TT4結(jié)果比初發(fā)現(xiàn)時(shí)有好轉(zhuǎn)，簡(jiǎn)稱緩解組），完全緩解患者12例（TSH、TT3、TT4結(jié)果完全正常，簡(jiǎn)稱完全緩解組）及復(fù)發(fā)患者11例（TSH、TT3、TT4正常后再出現(xiàn)符合GD結(jié)果，簡(jiǎn)稱復(fù)發(fā)組），其中男性39例，女性69例，年齡11～80歲。抽血2 mL用EDTA-K2抗凝全血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3-CD19+占淋巴細(xì)胞比值。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 儀器

美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司FC500流式細(xì)胞儀。

1.2.2 試劑

CD3-CD19+試劑使用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)tetraCHROME 45/56/19/3四色試劑盒。

1.3 方法

按試劑盒說明及儀器要求操作：緩慢混勻全血后取100μL加入流式儀專用試管中；吸取45/56/19/3四色試劑10μL加入混勻放室溫避光孵育15 min；加500μL Optilyse C溶血素后放室溫避光10 min；加500μL PBS室溫避光10 min；1 500 rpm離心5 min，棄上清液；加1 mL PBS懸浮細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0軟件對(duì)各組CD3-CD19+淋巴細(xì)胞百分比進(jìn)行正態(tài)分布及方差分析（Student Newman Keuls Test），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常對(duì)照組CD3-CD19+結(jié)果為13.70±5.33，初發(fā)組結(jié)果為19.30±8.54，緩解組結(jié)果為15.70±5.91，完全緩解組結(jié)果為12.73±4.32，復(fù)發(fā)組結(jié)果為14.99±5.83，初發(fā)組明顯高于正常對(duì)照組、緩解組、完全緩解組及復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002、0.023、0.002、0.026）；其他各組比較雖有差異，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

B淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，在機(jī)體的體液免疫中有重要作用，通過分泌抗體、抗原提呈、產(chǎn)生炎癥因子及免疫調(diào)節(jié)因子、提供協(xié)同刺激信號(hào)、調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化途徑及調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞功能等發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能，而Th細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子或表面因子受體，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、干擾素γ（IFNγ）等，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，通過中和毒素、激活補(bǔ)體等發(fā)揮體液免疫作用。Th1和Th2細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相互調(diào)節(jié)或交叉調(diào)節(jié)，Th1/Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子維系著Th1/Th2細(xì)胞的平衡，如一旦Th1/Th2平衡被打破，Th1或Th2漂移使Th1或Th2為優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，從而造成病理性免疫反應(yīng)。而不管是體液免疫應(yīng)答還是細(xì)胞免疫反應(yīng)都與Th1/Th2細(xì)胞的平衡有密不可分的關(guān)系。

B淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或表面因子受體與某些效應(yīng)物質(zhì)等組成一個(gè)重要的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，通過各種分泌形式，廣泛而精細(xì)地調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和分泌功能，并參與自身免性GD的發(fā)生、發(fā)展過程。B 淋巴細(xì)胞功能的異?；驍?shù)量的變化在體液免疫缺陷中有重要意義。在抗原刺激下，B細(xì)胞被激活，增殖形成生發(fā)中心，進(jìn)一步分化為分泌抗體的漿細(xì)胞或長(zhǎng)壽的記憶B細(xì)胞。CD3-CD19+是B細(xì)胞表面的糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，從B祖細(xì)胞開始表達(dá)，一直持續(xù)于整個(gè)B細(xì)胞成熟，在B細(xì)胞活化過程中不消失，CD3-CD19+高低代表B細(xì)胞水平[3]，在B細(xì)胞活化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起協(xié)同受體的作用， 參與B細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[4]及調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化及增殖，在B細(xì)胞活化輔助受體中，CD3-CD19+發(fā)揮重要作用。所以CD3-CD19+反映B淋巴細(xì)胞的功能。B細(xì)胞數(shù)量增加和活化則是分泌自身抗體的基礎(chǔ)，有研究表明GD病程發(fā)生發(fā)展中有自身抗體參與和器官特異性免疫損傷[5]。也有研究表明GD患者131I治療后細(xì)胞免疫異常、協(xié)同刺激分子的表達(dá)有不同程度的改善，對(duì)機(jī)體的T、B細(xì)胞也有免疫調(diào)控作用[6]。

表1 方差分析均數(shù)兩兩比較表Table 1 Multiple comparison in ANOVA

表1結(jié)果顯示初發(fā)組CD3-CD19+百分比值均高于于正常對(duì)照組、緩解組、完全緩解組及復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（P分別為 0.002、0.023、0.002、0.026），說明體液免疫反應(yīng)水平增強(qiáng)。緩解組結(jié)果與正常對(duì)照組比較雖沒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但數(shù)值比正常對(duì)照組高，說明體液反應(yīng)水平還是比正常人有所增強(qiáng)。完全緩解組結(jié)果低于正常對(duì)照組，差異沒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從數(shù)據(jù)比較中或者可以考慮經(jīng)過治療后，體液免疫反應(yīng)水平比正常對(duì)照組有所減弱。而復(fù)發(fā)組結(jié)果與正常對(duì)照組比較雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但結(jié)果比正常對(duì)照組高，說明體液免疫反應(yīng)水平又有所增強(qiáng)。從所有的結(jié)果來分析，從初發(fā)到緩解到完全緩解及復(fù)發(fā)全過程，CD3-CD19+的結(jié)果都與整個(gè)病程的免疫反應(yīng)相一致。說明體液免疫反應(yīng)在GD程中都起到很重要的作用，但對(duì)于是否因?yàn)锳TD藥物作用于免疫系統(tǒng)糾正免疫功能達(dá)到治療GD效果，還是因?yàn)樗幬镒饔糜诩谞钕購(gòu)亩纳企w液免疫反應(yīng)的機(jī)理還有待更進(jìn)一步的研究。同時(shí)，在治療過程中，免疫功能特別是體液免疫如抗體、分泌的細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體的損傷或影響也有待研究，其他研究顯示屬于體液免疫功能的抗體檢測(cè)如甲狀腺球蛋白抗體（anti-thyroglobulin antibody，TGAb）及甲狀腺過氧化物酶抗體（antithyroid peroxidase antibody，TPO-Ab）的結(jié)果也說明了體液免疫反應(yīng)在GD及其他自身免疫性甲狀腺疾病中的重要作用及在這些疾病中診斷、治療及預(yù)后提供重要依據(jù)[7～8]。

從表中數(shù)據(jù)提示復(fù)發(fā)組結(jié)果比初發(fā)組結(jié)果低，P＜0.05（0.026），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而稍高于正常對(duì)照組結(jié)果，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05（0.782），應(yīng)該也可以說明復(fù)發(fā)組病人的體液免疫反應(yīng)水平由于免疫耐受或再次應(yīng)答反應(yīng)減弱造成；而完全緩解組結(jié)果低于正常對(duì)照組，差異雖沒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，很可能是治療過程中免疫反應(yīng)受到抑制或免疫耐受所致。

然而，B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，其活化、增殖、分化、免疫應(yīng)答及應(yīng)答耐受等都受到很多自身因素或藥物等不可預(yù)知的因素或機(jī)制影響，因而CD3-CD19+結(jié)果在GD的診斷、防治中的作用也許有一定的局限性，但從數(shù)據(jù)分析中對(duì)于GD的診斷、治療是有臨床意義的，同時(shí)也引導(dǎo)我們作更深入的研究。

GD的發(fā)生機(jī)理及免疫功能反應(yīng)復(fù)雜,通過更多的實(shí)驗(yàn)研究及隨著體液免疫及B淋巴細(xì)胞的研究進(jìn)一步發(fā)展和深入，如調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）[9]、Toll樣受體（TLR）[10]、易感染基因[11]、遺傳因素[12]等研究所取得的成果，必定會(huì)為GD的致病機(jī)理及免疫作用作出更充分、更完善的詮釋，為GD的診斷、治療及預(yù)防或預(yù)防復(fù)發(fā)提供更充分的依據(jù)。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南》編寫組. 中國(guó)甲狀腺疾病診治指南——甲狀腺功能亢進(jìn)癥[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2007, 46(10): 876-882．

[2] Phenekos C, Vryonidou A, Gritzapis A D, et a1. Thl and Th2 serum cytokine profiles characterize patients with Hashimoto's thyroiditis (Th1) and Graves' disease (Th2)[J].Neuroimmunomodulation, 2004, 11(4): 209-213．

[3] Lindsley R C, Thomas M, Srivastava B, et a1. Generation of periphral B cells occurs via two spatially and temporally distinct pathways[J]. Blood, 2007, 109(6): 252l-2528.

[4] Otero D C, Anzelon A N, Rickert R C. CD19 function in early and late B cell development: I. Maintenance of follicular and marginal zone B cells requires CD19-dependent survival signals[J]. J Immunol, 2003, 170(1): 73- 83.

[5] Ishii N, Takahashi T, Soroosh P, et al. OX40-OX40 ligand interaction in T-cell-mediated immunity and immunopathology[J]. Adv Immunol, 2010, 105: 63-98．

[6] 施比旻, 杜宣, 王勤. Graves病患者131I治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群OX40/OX40L表達(dá)的變化及臨床意義[J]. 中華核醫(yī)學(xué)分子影像雜志, 2013, 33(1): 42-45．

[7] 楊蓉, 潘秀軍. TGA、TPO-Ab、TRAb和TSH在自身免疫性甲狀腺病中的臨床應(yīng)用[J]. 放射免疫學(xué)雜志, 2012,25(5): 541-544.

[8] 王旭, 張會(huì)英. 甲狀腺自身抗體定量檢測(cè)的臨床應(yīng)用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2010, 14(8): 1249-1251.

[9] Blair P A, Nore?a L Y, Flores-Borja F, et a1. CDl9+CD24hiCD38hiB cells exhibit regulatory capacity in healthy individuals but are functionally impaired in systemic Lupus Erythematosus patients[J]. Immunity, 2010, 32(1): 129-140.

[10] Lampropoulou V, Hoehlig K, Roch T, et a1. TLR-activated B cells suppress T cell-mediated autoimmunity[J]. J Immunol,2008, 180(7): 4763-4773．

[11] Hsiao J Y, Hsieh M C, Tien K J, et al. Exon 33T/T genotype of the thyroglobulin gene is a susceptibility gene for Graves'disease in Taiwanese and exon 12 C/C genotype protects against it[J]. Clin Exp Med, 2008, 8(1): 17-21.

[12] Eschler D C, Hasham A, Tomer Y. Cutting edge: the etiology of autoimmune thyroid diseases[J]. Clin Rev Allergy Immunol,2011, 41(2): 190-197.