造血干細胞移植術后人巨細胞病毒包膜糖蛋白gB抗原血癥及gB特異性CD8+ T細胞測定

劉安兵 黃雅萍 胡建華 梁韓英 楊鎔 王慧琦 陳曉明 范駿

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是皰疹病毒科β屬的一種機會性致病性雙鏈DNA病毒，當機體免疫力低下尤其異基因造血干細胞移植術后HCMV的激活增加了威脅生命的多種并發癥的風險[1～3]。在異基因造血干細胞移植術后，有效的HCMV特異性CD8+T細胞免疫應答能夠長期避免HCMV激活和疾病的發生[4]。因此，研究移植術后HCMV感染狀態和CD8+T細胞免疫機制可能對控制病毒感染建立理論基礎。

目前病毒即刻早期（immediate-early，IE）和磷蛋白 65（phosphoprotein 65，pp65）抗原的檢測尤其pp65抗原血癥的檢測更被認為是診斷HCMV活動性感染的“標準方法”之一[5～6]。包膜糖蛋白B（glycoprotein B，gB）是由HCMV UL55編碼的最重要包膜抗原之一，檢測gB抗原可能有助于診斷和監測HCMV感染。gB具有重要的免疫原性，不僅能夠誘導機體產生中和抗體[7]，而且還能誘導特異性CD8+T細胞免疫，是T細胞免疫應答的重要靶抗原[8～9]。因此，檢測gB誘導的特異性T細胞對闡明HCMV致病機理具有重要作用。

本研究檢測了92份異基因造血干細胞移植術后病人外周血白細胞標本gB、 IE和pp65抗原，探討了gB抗原檢測的應用價值；分析了gB特異性CD8+T細胞在移植術后控制HCMV感染的免疫應答效應。

1 方法

1.1 標本來源及分組

共收集外周血EDTA抗凝標本92份。標本來源于異基因造血干細胞移植術后本院住院和門診隨訪病人，排除二次移植及術前檢測HCMV pp65或IE抗原陽性的病人，共64例（男性34例，女性30例），平均年齡29.7±9.9歲（10歲～55歲），術前原發病包括髓性白血病（42例），淋巴細胞性白血病（16例），骨髓異常增生綜合癥（3例），再生性障礙性貧血（2例）和淋巴瘤（1例）。

根據病人行移植術之日至此次檢測的時間長短對所收集的待測標本進行分組：A組（0≤時間間隔/月≤3），共22份標本；B組（3＜時間間隔/月≤12），共27份標本；C組（時間間隔/月＞12），共43份標本。

1.2 外周血白細胞gB、pp65和IE抗原檢測

取新鮮EDTA 抗凝血5 mL，分離白細胞并制作白細胞涂片[10]。免疫組化二步法檢測gB、pp65和IE抗原。商品化鼠源性HCMV gB單克隆抗體購自美國Novus公司，HCMV pp65單克隆抗體、IE單克隆抗體和EnVisionTMSystem檢測試劑盒購自丹麥Abcam公司。光學顯微鏡為日本產OLYMPUS（CHA213）。操作流程參照廠商說明書進行。以正常MRC-5細胞和HCMV Towne株感染的MRC-5細胞分別為陰性對照和陽性對照。MRC-5和HCMV標準株Towne株購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。陽性細胞呈棕黃色或棕褐色，陰性細胞呈淡藍色。陽性結果以陽性細胞數/5×104WBC表示[11]。

1.3 gB抗原T細胞表位篩選及MHC-肽五聚體合成

根據gB蛋白（登錄號：M60929）氨基酸序列，應用SYFPEITHI算法[12]和高通量的REVEALTM主要組織相容性抗原-肽結合力測定[13]預測、篩選出7條潛在的HLA-A*1101限制性的gB九肽。氨基酸序列如下：P1，VTITTARSK；P2，ISWDIQDEK；P3，MTATFLSKK；P4，GTVFVAYHR；P5，VTINQTSVK；P6，KVLRDMNVK；P7，TSYNQTYEK。然后合成HLA-A*1101-gB九肽五聚體（ProImmune公司）。

選取異基因造血干細胞移植受者16例，術后100天采集外周全血標本16份，Ficoll密度梯度離心法分離出16份PBMCs，Ficoll液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，分別用合成的7種五聚體進行染色，每種五聚體染色一次，進行MHC-肽五聚體實驗。

1.4 MHC-肽五聚體實驗

五聚體染色根據試劑說明書進行。1×106個外周血單個核細胞（PBMCs）加入2μL的五聚體孵育10 min，用2 mL洗液洗滌兩次，之后加入8μL的FluoroTag-藻紅蛋白（PE）和1μL異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD8單克隆抗體（ProImmune公司）于4℃避光孵育20 min。2 mL洗液洗滌兩次后Beckman Coulter流式細胞儀（FC500 MPL，Fullerton，CA）進行分析，至少分析100 000個細胞。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件包進行統計分析。抗原檢測陽性率比較采用配對四格表資料McNemar檢驗、相關性分析采用Spearman相關分析；組內陽性率比較采用配對四格表資料Fisher確切概率法；組間陽性率比較采用四格表資料校正χ2檢驗；gB332-340五聚體+CD8+T細胞頻率與gB抗原血癥的相關性分析使用Pearson相關分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 gB、IE和pp65抗原檢測

外周血白細胞樣本中HCMV gB抗原檢測陽性細胞棕褐色染色明顯，邊界清晰，區別于淡藍色的陰性細胞，見圖1所示。92份標本的gB抗原、IE抗原和pp65抗原檢測陽性率分別為82.6%（76/92）、92.4%（85/92）和90.2%（83/92），兩兩比較：gB抗原和IE抗原陽性率差異有顯著性（P=0.035）；gB抗原和pp65抗原陽性率差異無顯著意義（P=0.065）；pp65抗原和IE抗原陽性率差異無顯著意義（P=0.727）。三者抗原檢測結果兩兩之間均呈正相關（rgB&IE=0.827，P=0.000 ；rgB&pp65=0.877，P=0.000 ；rIE&pp65=0.912，P=0.000）。

圖 1 酶免疫組化pp65抗原血癥檢測Figure 1 Detection of pp65 antigenaemia in a leucocytic sample by enzyme immunohistochemistry

2.2 組內及組間gB、IE和pp65抗原檢測比較

A、B、C三組組內gB、IE和pp65抗原檢測陽性率分別為：（1）A 組：86.4%（19/22）、90.9%（20/22）和 90.9%（20/22）；（2）B 組：88.9%（24/27）、100%（27/27）和 92.6%（25/27）；（3）C 組：76.7%（33/43）、88.4%（38/43）和88.4%（38/43）。其中C組gB抗原和IE抗原之間（P=0.005）、gB抗原和pp65抗原之間陽性率差異有統計學意義（P=0.005）；A組內gB抗原和IE抗原之間（P=1.000）、gB抗原和pp65抗原之間（P=1.000）陽性率差異無顯著意義；B組內gB抗原和IE抗原之間（P=0.236）、gB抗原和pp65抗原之間（P=1.000）陽性率差異無顯著意義。在C組中，gB陰性而IE或pp65陽性的標本，其IE或pp65陽性值處于一個較低的范圍（1～6/5×104WBC）。

A、B、C三組組間gB、IE和pp65抗原檢測陽性率比較：同種抗原檢測陽性率組間差異均無顯著性，即三種抗原在移植術后不同時期內的陽性率保持穩定。

2.3 gB表位篩選和gB特異性CD8+ T細胞測定

選取16例異基因造血干細胞移植HLA-A*1101受者于移植后100天采集外周全血標本16份，分離出16份PBMCs，分別用合成的7種不同五聚體進行染色，每種五聚體染色一次，各種五聚體+CD8+T細胞的均值如下：P1，0.14%；P2，0.23%；P3，0.18%；P4，0.16%；P5，0.15%；P6，0.16%；P7，0.15%。各種五聚體測定對應的染色陽性的細胞進行兩兩比較，結果顯示P2（gB332-340）對應的五聚體+CD8+T細胞與其它九肽對應的五聚體+CD8+T細胞相比具有顯著性差異（P＜0.05）。圖2為1例異基因造血干細胞移植患者術后100天流式細胞術檢測外周血gB332-340特異性的CD8+T細胞的結果。gB九肽（ISWDIQDEK）可能是HLA-A*1101限制性的相對優勢抗原肽。分析發現，gB332-340特異性的CD8+T細胞的頻率與外周血gB抗原血癥的發生呈負相關（r=-0.6721；P=0.0043）。

圖 2 流式細胞術外周血gB332-340特異性的CD8+ T細胞檢測Figure 2 Detection of gB332-340-specific CD8+ T cells in a peripheral blood sample by flow cytometry

3 討論

人巨細胞病毒是異基因造血干細胞移植術后感染的常見病原體，盡管目前常規采取術前預防性抗病毒治療，HCMV仍然是導致患者術后感染和死亡的重要原因之一[14]。gB是HCMV最重要的包膜糖蛋白之一，參與病毒穿入宿主細胞、細胞間傳播[15]以及感染細胞間融合[16]過程。鑒于gB蛋白在HCMV感染中的重要作用，檢測gB抗原可能有助于診斷和監測HCMV感染。

在與pp65和IE抗原檢測的比較中發現，gB抗原與pp65和IE抗原均呈正相關（rgB&IE=0.827 ；rgB&pp65=0.877 ；rIE&pp65=0.912），其陽性率（82.6%）和pp65抗原陽性率（90.2%）的差異無顯著意義（P=0.065），但比IE抗原陽性率（92.4%）低（P=0.035）。HCMV的復制周期可以分為三個階段：即刻早期、早期和晚期[17]。蛋白IE、pp65和gB分別在復制周期的即刻早期、晚期和晚期合成[17～19]；而在一個病毒復制周期中，gB的合成完成更晚于pp65；gB是組成病毒包膜結構的蛋白之一，膜蛋白合成成熟意味著病毒即將完成裝配。這似乎可以解釋gB抗原檢測陽性率低于IE抗原檢測陽性率，而與pp65抗原檢測陽性率無差異。我們仍需要擴大樣本含量得以證實這一結果。在對待測樣本的檢測中，大部分的標本可同時檢測到三種抗原，表明在病毒復制周期中蛋白質的合成不是完全獨立的過程，而是一個有序并重疊關聯的過程。

為了比較移植術后不同時期三種病毒抗原的檢測情況，我們將待測樣本分組并排除二次移植及術前pp65或IE抗原陽性等因素：A組（移植術后3個月內）、B組（移植術后3個月至1年）和C組（移植術后1年以上）。三種抗原檢測陽性率在移植術后1年內差異無顯著性，這提示在移植術后短期或中期的HCMV檢測中，類似于IE和pp65，gB有潛在的早期診斷價值。值得注意的是，由于gB合成成熟預示著病毒的裝配完成，及在病毒穿入和細胞間傳播中的重要作用[20～21]，gB抗原陽性可能是一個提示病毒感染能力的指標。在異基因造血干細胞移植術后3個月內，HCMV感染與急性移植物抗宿主病及急性排斥反應的發生相關[22]，嚴重的HCMV病可能導致移植失敗甚至死亡；相應地，病毒檢測應首先滿足早期診斷的需要以便臨床預先干預和治療，此時選擇病毒復制早期的抗原（如IE抗原）更具預防意義。對于移植術后長期隨訪的病人來說，控制慢性排斥反應和維持機體各器官功能的平衡穩定相對更為重要[23]，同時，抗病毒需要提高機體免疫功能而可能導致排斥的發生[24]；相應地，病毒檢測應首先滿足確定診斷的需要以防抗病毒藥物加重臟器負擔。因此，此時應選擇病毒復制晚期的抗原（如gB抗原）以減少病毒感染的假陽性診斷。在此次研究中，移植術后1年以上的標本，其gB抗原陽性率低于IE和pp65抗原陽性率（P=0.005）；并且，在gB陰性而IE或pp65陽性的標本中，IE或pp65陽性值處于一個較低的范圍（1～6/5×104WBC）。這些提示，gB抗原血癥檢測是在監測移植術后長期隨訪病人HCMV感染中對IE和pp65抗原血癥檢測方法的一種補充。

我們應用基于流式細胞術的五聚體技術成功篩選出HLA-A*1101限制性的gB相對優勢抗原九肽gB332-340，認為gB是CD8+T細胞免疫應答的靶抗原。另外發現gB332-340特異性的CD8+T細胞的頻率與外周血gB抗原血癥的發生呈負相關（r=-0.6721；P=0.0043），或許gB332-340特異性的CD8+T細胞在控制HCMV感染中起到重要作用。我們下一步將深入探討gB332-340特異性的CD8+T細胞的功能（如細胞毒性分析、細胞因子分泌等）。這些工作將為HCMV致病機理的闡述和T細胞過繼免疫治療打下堅實基礎。

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