食品中腐敗酵母的實時熒光PCR 鑒定

陳世瓊，逄波，蔡雪鳳，伊鋆，郭錚蕾，付浦博，饒紅

1(國家食品質量安全監(jiān)督檢驗中心，北京，100094)2(中國疾病預防控制中心，北京，1022062)

3(北京市出入境檢驗檢疫局，北京，100026)

近幾年來，由于食品防腐劑和輻照技術的普遍應用，造成酵母菌引起的食品腐敗問題越來越多。此外，在低pH 值、低水活性、低濕度、含鹽量或含糖量高的食品中，由于酵母菌的抵抗力較強，其食品腐敗也多由酵母菌引起。食品腐敗不僅造成經濟損失，而且給消費者的健康帶來威脅。容易發(fā)生酵母菌腐敗的產品有發(fā)酵食品、腌漬食品、濃縮果汁、蜂蜜、果醬、肉、海產食品、奶制品、焙烤食品、飲料等。

釀酒酵母、魯氏接合酵母、斯巴達克畢赤酵母和布魯塞爾德克酵母等在食品中的殘留均可導致食品腐敗。其中，魯氏接合酵母是最常見的嗜滲酵母，常引起糖漿、果醬、果汁等高糖食品的變質［1－7］。釀酒酵母是常見的導致果汁腐敗的酵母［8－10］。其他酵母導致食品腐敗的事件也有報道。本文針對釀酒酵母、魯氏接合酵母、斯巴達克畢赤酵母和布魯塞爾德克酵母的基因保守序列，設計或篩選實時熒光PCR 鑒定用的探針引物，建立了針對這4 種酵母的實時熒光PCR 鑒定方法，并用所建立的方法對分離自市售食品的未知酵母進行了鑒定。實時熒光PCR 方法鑒定酵母，全過程僅需約3 h，與常用的生化鑒定方法相比，實時熒光PCR 方法簡化了鑒定步驟，提高了鑒定準確性，縮短了鑒定時間。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用的菌株見表1。

表1 本研究使用的菌株Table 1 Strains used in this study

其中，編號為1 ～4 的釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達畢赤酵母為目的標準菌株;5 ～13 為參比菌株，其中，10 為黑曲霉(ATCC 16404)，11 ～13 為細菌，其他食品中常見的其他腐敗酵母。14 ～75 為分離自蜂蜜、糕點、水或飲料的未知酵母。

1.2 儀器及試劑

實時熒光PCR 儀(ABI 7300);生化培養(yǎng)箱。

反應預混液(2 ×TaqMan Universal Master Mix，ABI)(Cat. No. :4427788);酵母基因組提取試劑盒(Cat. :No. :DP 307 －02)，天根生化科技有限公司(以下簡稱天根公司);細菌基因組提取試劑盒(Cat. No. :DP 302 －02)，天根公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)及DNA 提取

將表1 中的菌株用表2 中的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)，取培養(yǎng)液用天根公司酵母或細菌基因組提取試劑盒提取DNA。

表2 本研究使用菌株的培養(yǎng)條件Table 2 Culture conditions used in this study

1.3.2 探針、引物的設計、選擇及檢測方法的建立

(1)探針、引物的設計及合成

釀酒酵母的探針、引物由文獻［13］查得。魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達畢赤酵母的探針、引物根據其ITS1、5.8 S、ITS2 序列設計。所有引物、探針均由上海英駿生物技術有限公司合成。

(2)實時熒光PCR 檢測方法的建立

分別以表1 中目的菌株和參比菌株(1 ～13)的DNA 為模板，配制20 μL 實時熒光PCR 反應體系，組成如下:含10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)1 μL，模板50 ～100 ng，用滅過菌的雙蒸水補足至20 μL。在ABI 7300 擴增，根據Ct 值判斷探針、引物的有效性和特異性。4 種目的酵母的實時熒光PCR 擴增條件見表3。

表3 實時熒光PCR 鑒定方法的擴增條件Table 3 Amplification conditions of real-time PCR identification method

(3)實際樣品中分離出的未知酵母菌的鑒定

分別使用針對不同目的菌株的探針、引物，以表1 中未知菌株的DNA 為模板，配制20 μL 實時熒光PCR 反應體系，組成如下:含10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探針(10 μmol/L)1 μL，模板50 ～100 ng，用滅過菌的雙蒸水補足至20 μL。在ABI 7300 上擴增，根據Ct值判斷未知酵母是否是所要鑒定的酵母菌。

2 實驗結果與分析

2.1 實時熒光PCR 法鑒定4 種腐敗酵母探針、引物的有效性及特異性實驗

篩選或設計的針對4 種腐敗酵母鑒定用的探針、引物的有效性及特異性試驗結果見表4。

表4 針對4 種腐敗酵母實時熒光PCR 法鑒定用的探針、引物的有效性及特異性實驗結果Table 4 Effectiveness and specificity of the probes and primers for the 4 kinds of spoilage yeast

從表4 可以看出，本研究所設計或篩選的針對釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達畢赤酵母實時熒光PCR 探針和引物對目的菌株有高度的特異性，在本研究所使用的擴增條件下，4 種目的菌株的擴增曲線的Ct 值分別為21.07、28.60、25.50 和24.04，其他酵母、曲霉和細菌標準菌株或參比菌株擴增曲線的Ct 值均顯示為“UNDETECT”。說明所使用的引物和探針對各自的目標酵母菌具有特異性。

2.2 分離自樣品的未知酵母實時熒光PCR 方法快速鑒定

分別使用針對釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達畢赤酵母實時熒光PCR 方法鑒定用的探針和引物，以分離自食品樣品的60 余株未知酵母的DNA 為模板，使用ABI 公司生產的反應預混 液(2 ×TaqMan Universal Master Mix，ABI)(Cat. No. :4427788)配制20μL 反應體系，使用表3中的擴增條件，對分離自食品樣品的60 余株未知酵母進行快速鑒定。

鑒定結果發(fā)現，編號為10 －1、10 －2、10 －3 及10 －5 的4 株菌為釀酒酵母，他們均分離自果汁飲料。另外，有21 株為魯氏接合酵母，其實時熒光PCR反應Ct 值均在24 ～29 之間，全部分離自蜂蜜樣品。60 余株未知酵母中的約35 株為與釀酒酵母、魯氏接合酵母、布魯塞爾德克酵母及斯巴達畢赤酵母不同的酵母菌，有待進一步鑒定。

［1］ Saksinchai S，Suzuki M，Chantawannakul P，et al.A novel ascosporogenous yeast species，Zygosaccharomyces siamensis，and the sugar tolerant yeasts associated with raw honey collected in Thailand［J］． Fungal Diversity，2012，52(1):123 －139.

［2］ Shneider A，Horn H，Hammes W P.The occurrence of osmophilic yeasts in honey［J］． Dtsch Lebensm-Rundsch，2003，99(8):310 －319.

［3］ Park Y K，KOO M H，De Aguiar Oliveira I M.Biochemical characteristics of osmophilic yeasts isolated from pollens and honey［J］． Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1996，60(11):1 872 －1 873.

［4］ Sule Senses-Ergul，Zekiye Yesim Ozbas. Characterization of the yeast flora present in some Turkish high-sugar products［J］． J Gen Appl Microbiol，2006，52(2):99 －106.

［5］ Taing O K，Fumio Hashinaga. Identification of sugar-tolerant yeasts isolated high-sugar fermented vegetable extracts［J］． J Gen App Microbiol，1997，43(1):39 －47 .

［6］ TY KOH. The isolation of obligate osmophilic mutants of the yeastSaccharomyces rouxii［J］． Journal of General Microbiology，1975，88:184 －188.

［7］ Maria Jose?Leandro，1，2 Hana Sychrova?，2 Catarina Prista1 and Maria C. Loureiro-Dias. The osmotolerant fructophilic yeastZygosaccharomyces rouxiiemploys two plasmamembrane fructose uptake systems belonging to a new family of yeast sugar transporters［J］． Microbiology，2011，157:601 －608.

［8］ 胡斌，錢和. 釀酒酵母菌含量對控制橙汁腐敗的影響［J］． 食品工業(yè)科技，2009，30(1):186 －188.

［9］ Tournas V H，Heeres J，Burgess L. Moulds and yeasts in fruit salads and fruit juices ［J］． Food Microbiology，2006，23(7):684 －688.

［10］ 陳瑤，賴崇德，劉玄，等. 橙汁釀酒酵母菌株的分離篩選和發(fā)酵性能的測定［J］． 江西農業(yè)大學學報，2007，29(4):665 －669.

［11］ 中華人民共和國衛(wèi)生部，GB 4789.10 －2010，《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》［S］，北京:中國標準出版社，2010

［12］ 陳世瓊，曹寶森，蔡雪鳳，等. 脂環(huán)酸芽孢桿菌的培養(yǎng)基篩選及優(yōu)化［J］． 中國釀造，2011(2):158 －160.

［13］ Francisco Salinas，Daniel Garrido，Angelica Ganga，et al. Taqman real-time PCR for the detection and enumeration ofSaccharomyces cerevisiaein wine［J］． Food Microbiology，2009，26(3):328 －332.