野鳶尾總黃酮的提取*

齊建紅，趙詠梅，方剛，李丹，王改改

(西安文理學院生物技術學院，陜西西安，710065)

野鳶尾(Iris dichotoma)為鳶尾科鳶尾屬植物，又名白射干、射干鳶尾，根莖或全草入藥，具有清熱解毒、止痛等功效。廣泛分布于黑龍江、吉林、內蒙古、陜西等地，生于沙質草地、山坡、丘陵等處［1］。常用于咽喉腫痛、胃痛、肝炎、乳腺炎、牙齦腫痛等治療［2］。迄今為止，從野鳶尾中已經分離得到了30多個化合物［3］，主要為黃酮類化合物［4］。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，它的生理活性較為廣泛，具有抗氧化抗衰老、抗菌抗病毒、免疫調節、治療腦血管病及降血脂等功能［5］。本文對野鳶尾中主要的活性成分——總黃酮的提取工藝進行了研究，以便更好地開發和利用野鳶尾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野鳶尾(采自陜西秦嶺紅河谷，經張九東老師鑒定為野鳶尾)，蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院)，硝酸鋁，亞硝酸鈉，無水乙醇等均為分析純。

UV－2450紫外分光光度計(日本島津公司)，JY92－2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，FZ102型微型植物試樣粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司)，萬分之一天平(德國賽多利斯)。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測波長的選擇

精密量取0.15 mg/mL蘆丁標準溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入體積分數60%的乙醇5 mL，再加入質量分數5%NaNO20.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入質量分數為10%的Al(NO3)30.3 mL，搖勻，放置6 min;最后加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，以空白試劑做對照，用紫外分光光度計在波長450～550的范圍內進行掃描，確定最大吸收波長。

1.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取野鳶尾粉末1.0 g于燒杯中。加入一定量60%的乙醇在一定溫度下200 W超聲一定時間趁熱減壓抽濾得上清液即可。

1.2.3 對照品溶液的制備與標準曲線的繪制［6］

精密稱取蘆丁標準品15 mg，于小燒杯中，用60%乙醇溶液溶解并轉移至100 mL棕色容量瓶中定容，搖勻，即得0.15 mg/mL的蘆丁標準溶液。精密量取蘆丁標準液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL分別置于10 mL容量瓶中;加入60%乙醇至5 mL;加入5%NaNO20.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min。最后加入1 mol/LNaOH溶液2 mL。用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，放置15 min后在波長510 nm處測定吸光度，，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，確定以乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)4個試驗因素進行正交設計，每因素3個水平(表1)，按照L9(34)正交表進行試驗，優化野鳶尾總黃酮的提取工藝。

1.2.5 樣品分析

對正交試驗溶液按1.2.3項下方法進行顯色，紫外分光光度計測定吸光度，計算樣品中總黃酮得率。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

從圖1可以看出，蘆丁在波長450～504 nm時吸光度不斷增大，當波長超過504 nm之后，吸光度呈下降趨勢，因此確定測定波長為504 nm。

圖1 檢測波長的掃描Fig.1 The scanning figure of detecting wavelength

2.2 蘆丁標準曲線的繪制

通過測定不同濃度的蘆丁對照品溶液吸光度值，以濃度(mg/mL)對吸光度值進行回歸分析，得回歸方程為Y=12.674X+0.0044，R2=0.999 4。結果表明蘆丁含量在0.0～0.75 mg/mL與吸光度呈現良好的線性關系，如圖2所示。

圖2 方法-標準曲線Fig.2 Methed－standard curves

2.3 方法學考察［7］

2.3.1 精密度試驗

精密吸取蘆丁對照品溶液3.00 mL于10 mL容量瓶中，加60% 乙醇5 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對照品為空白，在504 nm處測定吸光度，連續6次，平均吸光度為0.582，計算得RSD為1.04%，精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗

精密吸取1份野鳶尾供試品溶液3 mL，按照1.2.3 項中的方法顯色，分別于間隔0、10、20、30、40、50、60 min，在504 nm波長處測定吸光度。結果顯示，1 h內吸光度值無明顯變化，計算得RSD 1.22%，供試品溶液顯色后在1 h內穩定。所得總黃酮穩定性好，適宜于生產應用。

2.3.3 重復性試驗

按照野鳶尾供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液(相同藥材重量)，然后分別按照1.2.3項中的方法顯色進行測定，計算野鳶尾總黃酮得率，RSD 1.42%，此方法重復性良好。

2.4 正交試驗優選總黃酮提取工藝

從表2數據分析可知，乙醇濃度、提取時間、提取溫度、固液比4個因素對野鳶尾總黃酮提取的影響主次順序為:提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間。實驗的最優因素水平組合為A2B2C3D1，即，乙醇濃度為80%，提取時間為5 min，提取溫度為90℃，料液比1∶20。野鳶尾總黃酮的得率為4.007 mg/g。

表2 L9(34)正交試驗設計結果Table 2 Results of L9(34)orthogonal test

2.5 實驗因素對總黃酮提取量影響的方差分析

從方差分析結果(見表3)可知，乙醇濃度和提取溫度2個因素對總黃酮提取率都有顯著影響，液料比和提取時間的影響不顯著。提取溫度對總黃酮提取率影響最大，乙醇濃度對總黃酮提取率影響較大，其次，料液比對總黃酮的提取有一定影響，4個因素中，以提取時間影響最小。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis for the orthogonal array design experimental results

3 結論

野鳶尾可以作為觀賞植物，又具有一定的藥用價值，本實驗首次對野鳶尾總黃酮進行了提取工藝優化研究，結果表明，影響野鳶尾總黃酮的最佳提取工藝因素為提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間，最佳提取工藝條件為A2B2C3D1。即乙醇體積分數為80%，料液比1∶20(g∶mL)，提取時間為 5 min，提取溫度為90℃，此條件下總黃酮為4.007 mg/g。為野鳶尾中黃酮成分在食品藥品領域的開發利用研究提供了科學的理論依據。

［1］趙毓棠.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1985，16(1):134.

［2］王冰，徐巖，鄭太坤，等.射干鳶尾的核型分析［J］.中國藥學雜志，1998，33(12):716－719.

［3］齊建紅，翟永功，趙長琦.鳶尾屬植物的化學成分及其生物活性［J］.天然產物研究與開發，2006，18(1):165－170.

［4］齊建紅.野鳶尾植物的生物學特征及化學成分研究進展［J］.陜西農業科學，2013，(2):121－123.

［5］曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展［J］.西北植物學報2003，23(12):2241－2247.

［6］扶慶權，徐鑒.正交試驗法優化草莓中總黃酮的提取工藝研究［J］.中國食品添加劑，2011(6):130－135.

［7］陶阿麗，戴一，華芳.桂花中總黃酮提取工藝及采收期研究［J］.食品與發酵工業，2013，39(2):247－249.