5 種食用菌液體發(fā)酵菌絲抗氧化活性分析比較

陸武祥，王東華，王秀英，徐艷

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽，110161)

氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中不斷產(chǎn)生活性氧，活性氧能對許多生物大分子，比如DNA、蛋白質(zhì)、脂肪酸產(chǎn)生破環(huán)作用，造成其相關(guān)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的損傷［1］。到目前為止，醫(yī)學(xué)界已發(fā)現(xiàn)近百種疾病都與自由基有關(guān)，尤其是退化性疾病，如動脈粥樣硬化、腫瘤、白內(nèi)障、輻射損傷、燒傷、衰老、關(guān)節(jié)炎、肺病、腎病與肝病等［2］。而抗氧化劑能捕獲并中和自由基，從而去除自由基對人體的損害。從天然植物中提取有效成分研制新型抗氧化劑取得了很好的效果。但是植物受生長環(huán)境、氣候等方面的限制，資源有限，而且大量砍伐會造成生態(tài)環(huán)境的破壞。因此，尋找新的天然產(chǎn)物開發(fā)抗氧化劑具有重要意義。食用真菌中含有許多對人體有益的活性成分，具有清除自由基、抑菌殺菌及抗輻射等功能。隨著現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步，食用真菌的生產(chǎn)也由田間栽培發(fā)展到工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，這樣不但可以縮短周期、擴(kuò)大規(guī)模、提高效率、穩(wěn)定質(zhì)量，還為解決藥源開辟了一條新的途徑。研究表明，多種食用真菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷類、多糖類及甘露醇等含量遠(yuǎn)高于天然或人工栽培的大型真菌子實體或菌核［3］。因此，從食用真菌的液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取有效成分研制新型抗氧化劑不僅價格低廉、來源豐富而且安全天然，是尋找天然抗氧化劑的理想材料。本文比較了幾種食用真菌(猴頭菇、杏胞菇、香菇、金針菇、雞腿菇)液體發(fā)酵菌絲中多糖和蛋白含量及抗氧化活性，旨在為食用菌液體發(fā)酵產(chǎn)物的開發(fā)、利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

猴頭菇(Hericium erinaceus(Bull. )Per. )、杏鮑菇(Pleurotus eryngiiQuel. )、香 菇(Lentinus edodes(Berk. )Sing. )、金針菇(Flammulina velutiper(Fr. )Sing)、雞腿菇(Copyinds comatus(MUII. Fr)Gray)菌種，購自遼寧省農(nóng)科院;NBT(氯化硝基四氮唑藍(lán))，上海恒星應(yīng)用化學(xué)研究所;核黃素，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;1，1-二苯-2-苦肼基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，純度95%)，A Johnson Matthey Company;其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

數(shù)字恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司;低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;SL-202 型電子天平，上海長橋精密科學(xué)儀器有限公司。超凈工作臺，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;日光燈反應(yīng)箱，自制。

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)基的配制(g/L)

PDA 固體培養(yǎng)基含馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。不同菌種的種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基如下:

2.1.1 香菇

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏20 g，KH2PO41 g，MgSO41.5 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉40 g，酵母膏3 g，蔗糖25 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，VB10.05 g，pH 5.25。

2.1.2 杏鮑菇

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，麥麩40 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉30 g，麥麩20 g，酵母膏3 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g。

2.1.3 金針菇

種子培養(yǎng)基:玉米粉50 g，麥麩30 g，酵母膏10 g，蔗糖4 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB10.1 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉30 g，可溶性淀粉20 g，麥麩30 g，蛋白胨10 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB10.1 g。

2.1.4 猴頭菇

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉25 g，酵母膏25 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH5.0。

2.1.5 雞腿菇

種子培養(yǎng)基:蔗糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO41 g，

MgSO40.05 g，VB10.01 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖20 g，酵母粉5 g，麥麩40 g，玉米粉30 g，KH2PO43 g，MgSO41 g。

培養(yǎng)基每瓶100 mL 分裝于三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌，121℃滅菌20 min 后置于超凈臺冷卻備用。

2.2 菌絲的制備

將培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，27 ℃搖床中培養(yǎng)，待菌絲生長成熟后將其過濾，水洗后低溫烘干備用。

2.3 菌絲多糖及蛋白的提取

2.3.1 菌絲多糖的提取

將收集的菌絲干燥后研磨成粉末，取菌絲粉末各2 g 于試管中，加水20 mL，水浴加熱1 h 后，離心取上清液。

2.3.2 菌絲蛋白的提取

將收集的菌絲干燥后研磨成粉末，取菌絲粉末各2 g 于燒杯中，加水20 mL，凍融24 h，離心取上清液。

2.4 菌絲多糖及蛋白的含量測定

2.4.1 菌絲多糖含量的測定

多糖的含量測定:采用苯酚－硫酸法。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:將20 mg 葡萄糖溶解并定容至500 mL。分別量取母液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，定容至10 mL，各量取1 mL 溶液、1 mL 6%苯酚、5 mL 濃H2SO4搖勻放置10 min，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，在490 nm 波長處測定吸光度值。以含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

菌絲多糖含量測定:分別量取不同體積的各種菌絲多糖母液裝入具塞試管中，配制成濃度梯度。然后再從試管中分別量取1 mL 溶液裝入小試管中，并依次加入1 mL 6%苯酚溶液，5 mL 濃H2SO4，搖勻放置10 min，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，在490 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出不同菌絲中多糖含量。

2.4.2 菌絲蛋白含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線:取牛血清白蛋白，配制成濃度為1 mg/mL，用蒸餾水分別稀釋成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。準(zhǔn)確吸取各溶液0.1 mL，分別放入具塞試管中，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑，混勻，放置2 min 后，在595 nm 處測定吸光度值。

菌絲蛋白含量測定:分別量取不同體積的各種菌絲蛋白母液裝入具塞試管中，配制成濃度梯度。分別量取上述溶液0.1 mL 置于20 mL 具塞試管中，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑，混勻，放置2 min 后，在595 nm 處測定吸光度值。

2.5 菌絲抗氧化活性的體外測定

將各菌絲多糖和蛋白分別定容至25 mL，取各溶液分別進(jìn)行如下抗氧化活性的測定。

2.5.1 清除超氧自由基活性的測定［4］

采用光照核黃素體系產(chǎn)生超氧自由基。用0.05 mol/L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液為溶劑，配制1.67 ×10－5mol/L 核黃素，0.01 mol/L 蛋氨酸，4.6 ×10－5mol/L 氯化硝基四氮唑蘭(NBT)。分別取上述3 種溶液各2.0 mL，加入不同濃度的樣品溶液1.0 mL，空白管以1.0 mL 緩沖液代替樣品溶液。置于光照箱中光照20 min，取出后以緩沖溶液為參比于560 nm 處測定溶液的吸光度。清除率按下式計算。A0為空白管的吸光度，A樣為樣品管的吸光度。

清除率公式:

2.5.2 清除羥自由基活性的測定［5］

取各樣品液1 mL，加入12 mmol/L 水楊酸鈉0.5 mL，0.9 mol/L FeSO40.5 mL，最后加18 mmol/L H2O21 mL 啟動反應(yīng)，37 ℃恒溫水浴反應(yīng)1 h 后5 000 r/min 離心10 min，取上清液并稀釋至10 mL，在510 nm 分光光度計上測吸光值A(chǔ)，根據(jù)以下公式計算·OH 的清除率。

式中:A為不加樣品時體系的吸光值;A1為加入樣品后體系的吸光值;A2為樣品的本底吸光值。

2.5.3 清除DPPH·活性的測定［6］

采用提取物與穩(wěn)定自由基DPPH·反應(yīng)的分析方法。在同一具塞試管中加入2 mL DPPH 溶液(2 ×10－4mol/L)，1 mL 不同濃度樣品溶液，搖勻，室溫避光靜止30 min，用無水乙醇作參比在517 nm 處測定吸光度A 樣品。用1 mL 蒸餾水代替樣液，測定空白吸光度A 空白。用2 mL 無水乙醇代替DPPH，測定吸光度值A(chǔ) 對照。樣品對DPPH·的清除率計算:

2.5.4 還原力的測定［7］

本研究采用鐵離子還原法(FRAP)和鐵氰化鉀還原法來測定各樣品的還原力。具體方法:分別取2.5 mL 不同濃度的樣品于試管中，依次加入2.5 mL 0.2 moL/L pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1% K3［Fe(CN)6］于50 ℃水浴保溫20 min 后，快速冷卻，再加入2.5 mL 10% TCA，以4 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 重蒸水，0.5 mL 0.1%FeCl3，充分混勻，靜止10 min，以蒸餾水為對照在700 nm 處測定吸光度值。

2.6 抗氧化活性綜合評價分析法［8］

由于不同抗氧化活性測定方法測得的各個菌絲多糖、蛋白抗氧化活性各不相同。為了對5 種食用菌菌絲抗氧化活性進(jìn)行系統(tǒng)的綜合評價，采用綜合評價法對5 種菌絲多糖、蛋白的清除超氧陰離子自由基(O2－)、羥自由基(·OH)、DPPH 自由基、還原力進(jìn)行綜合評價。綜合評價法是將多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為一個能夠反映綜合情況的指標(biāo)來進(jìn)行評價，先分別按不同指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)對各評價指標(biāo)進(jìn)行評分，然后采用加權(quán)相加，求得總分，利用數(shù)字進(jìn)行比較更直觀、具體、可靠。根據(jù)極值標(biāo)準(zhǔn)化公式Zij=(Xij－Xijmin)/(Xijmax－Xijmin)，其中，Xij為第i個菌種第j個抗氧化方法指標(biāo)值。Xijmax、Xijmin分別為第i個菌種第j個抗氧化方法指標(biāo)的最大值和最小值。

3 結(jié)果與分析

3.1 各種菌絲多糖含量及抗氧化活性的測定

表1 不同菌絲多糖含量及抗氧化活性的測定結(jié)果Table 1 The determination results of the content and antioxidation activity of different mycelium polysaccharides

5 種菌絲多糖抗氧化活性的測定結(jié)果見表1。由表l 可知，除雞腿菇菌絲多糖抗氧化能力較弱外，其他菌絲多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但不同多糖對不同自由基的清除作用是不同的。5 種菌絲多糖含量順序為:金針菇＞猴頭菇＞杏胞菇＞香菇＞雞腿菇。5 種菌絲多糖超氧陰離子自由基清除率順序為:猴頭菇＞金針菇＞香菇＞杏胞菇＞雞腿菇。5 種菌絲多糖羥自由基清除率順序為:金針菇＞猴頭菇＞杏胞菇＞香菇＞雞腿菇。5 種菌絲多糖DPPH 自由基清除率順序為:金針菇＞杏胞菇＞香菇＞猴頭菇＞雞腿菇。5 種菌絲多糖還原力順序為:金針菇＞猴頭菇＞杏胞菇＞香菇＞雞腿菇。綜合評價法結(jié)果表明，5種食用菌菌絲多糖中，金針菇菌絲多糖的抗氧化活性最高。

3.2 各種菌絲蛋白含量及抗氧化活性的測定

5 種菌絲蛋白含量及抗氧化活性的測定結(jié)果見表2。由表2 可知，5 種菌絲蛋白水溶液均有一定抗氧化作用，但不同蛋白對不同自由基的清除作用不同，菌絲蛋白含量順序為:猴頭菇＞金針菇＞杏胞菇＞香菇＞雞腿菇;菌絲蛋白超氧陰離子自由基清除率順序為:金針菇＞猴頭菇＞杏胞菇＞香菇＞雞腿菇;菌絲蛋白羥自由基清除率順序為:杏胞菇＞猴頭菇＞金針菇＞雞腿菇＞香菇;菌絲蛋白DPPH 自由基清除率順序為:金針菇＞猴頭菇＞香菇＞杏胞菇＞雞腿菇;菌絲蛋白還原力順序為:猴頭菇＞杏胞菇＞香菇＞金針菇＞雞腿菇。綜合評價結(jié)果表明，5 種食用菌菌絲蛋白中，猴頭菇菌絲蛋白的抗氧化活性最高。

表2 不同菌絲蛋白含量及抗氧化活性的測定結(jié)果Table 2 The determination results of the content and antioxidation activity of different mycelium proteins

5 種食用菌菌絲多糖和蛋白抗氧化活性的測定結(jié)果顯示不同菌絲多糖和蛋白抗氧化活性不同，表明不同食用菌中含有的多糖和蛋白不同，以致抗氧化能力不同。同一種食用菌菌絲多糖和蛋白對不同自由基的清除能力各不相同，這可能是因為同一種食用菌菌絲中存在多種多糖或蛋白，不同多糖或蛋白結(jié)合不同自由基的能力不同，表明食用菌含有多種抗氧化活性物質(zhì)，但具體起抗氧化作用的物質(zhì)還需進(jìn)一步分離鑒定。不同菌絲中多糖或蛋白含量不同，菌絲中多糖或蛋白含量越高，綜合抗氧化活性越強(qiáng)。

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