低產乙醛啤酒酵母的定向馴化篩選*

沈楠，王金晶，劉春鳳，李永仙，李崎

1(江南大學教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

2(江南大學釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫，214122)

乙醛，啤酒中含量最高的揮發性醛，是啤酒生青味、爛蘋果味的主要來源，其含量的高低直接決定了啤酒的品質。成熟的優質啤酒的乙醛含量一般在3～8 mg/L［1］。乙醛是引起“上頭”的物質之一，并具有致癌作用，國外學者對其致癌性和毒性已進行了大量的研究［2］。因此，目前關于乙醛的研究重點是如何降低其在啤酒中的含量。

國內外的啤酒生產一般都是通過釀造工藝的調整來降低乙醛的含量［3－6］。但要從根本上解決成品啤酒中乙醛含量偏高的問題，選育低產乙醛的啤酒酵母是最理想的措施和手段。因此很多研究者利用分子手段通過基因工程的方法改良菌種來改變乙醛的代謝能力［7－10］，以達到降低乙醛產量的目的。

在酵母的代謝途徑中(如圖1)，乙醛脫氫酶是乙醛代謝途徑中的關鍵酶之一。雙硫侖是乙醛脫氫酶的抑制劑，使乙醛不能氧化為乙酸，致使乙醛在胞內蓄積，乙醛是毒性物質，當胞內乙醛濃度升高時，可與一些蛋白質、磷脂、核酸等形成共價鍵結合，導致這些物質失活，從而引起機體的多種不適。目前國內外對雙硫侖的關注主要在醫藥領域，其作為戒酒、抗白內障、抗膠質瘤等藥物已被廣泛應用，尚未有研究報道其可作為酵母選育的“篩子”。本文設想利用雙硫侖篩選低產乙醛酵母，其原理如下:在含有雙硫侖的、以乙醇為唯一碳源的培養上，雙硫侖通過抑制乙醛脫氫酶的活性而抑制酵母的生長，然而酶活性相對較高的菌株由于乙醛脫氫酶活性只受到部分抑制因而能繼續在雙硫侖平板上生長。能產高活性乙醛脫氫酶的菌株，其代謝的乙醛可在該酶的作用下被快速轉化，從而使乙醛含量降低，由此即可篩選出低產乙醛的啤酒酵母。

圖1 酵母乙醛代謝途徑［4］Fig.1 The metabolic pathways of acetaldehyde in yeast

考慮到既要加快乙醛的代謝速度又不能過多改變該菌株的其他各項發酵指標，本研究決定采用紫外誘變的形式對酵母進行改良，利用雙硫侖平板初篩到高乙醛脫氫酶的酵母，再將其置于高濃度乙醛培養基連續馴養，進化出較強的乙醛代謝能力而篩選出優選菌，從代謝途徑上降低酵母代謝乙醛的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養基

釀酒酵母(Saccharomyces pastorianu)MI4，由本實驗室保藏。

無碳培養基:(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，酵母膏0.1 g/L，滅菌條件:121 ℃，20 min。

雙硫侖平板:在無碳培養基的基礎上，添加瓊脂、無水乙醇及一定濃度的雙硫侖。

乙醛培養基:(NH4)2SO45 g/L ，KH2PO41 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，酵母膏0.1 g/L，乙醛500 mg/L，滅菌條件:121 ℃，20 min。

YEPD 培養基:酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 6.0，滅菌條件:115 ℃15 min。

自制麥汁:滅菌條件:115 ℃15 min。

1.1.2 試劑

酵母浸出粉，蛋白胨購自英國OXOID;葡萄糖，無水乙醇，CaCl2，NaCl，(NH4)2SO4等，國藥集團;雙硫侖，鎮江天茂橡膠助劑有限公司;麥芽，中糧;99.5%乙醛，阿拉丁。

1.1.3 儀器

滅菌鍋，日本Hirayama-HVE-50;頂空氣相色譜儀(GC-2010 型)，日本島津(Shimadzu)公司;超凈臺，蘇凈集團安泰公司;生化培養箱SPX-250，上海躍進;HYG-A 全溫搖瓶柜，太倉市實驗設備廠。

1.2 方法

1.2.1 紫外誘變［11］

將對數期的酵母培養液以3 000 r/min 離心5 min，傾去上清液，生理鹽水洗滌1 次，洗滌后用生理鹽水重懸稀釋，使重懸液中酵母細胞數達到106～107CFU/mL 左右。取上述菌懸液10 mL 于9 cm 培養皿，同時放入一無菌磁力攪拌器，置于磁力攪拌器上，置于已開啟預熱10 min 的15 W 紫外燈下30 cm 處。開啟皿蓋照射10 ～70 s 后，稀釋涂布于YPD 平板，在避光條件下于28 ℃培養箱中培養48 h。

1.2.2 雙硫侖初篩

將預先用生理鹽水洗滌2 ～3 次的誘變菌涂布于含3.5 mg/L 的雙硫侖抗性平板上，培養4 ～5 d 后，挑取能生長在此平板上生長的菌株進行搖瓶發酵。

1.2.3 高濃度乙醛培養基馴化

經初篩后的酵母置于一定濃度的以乙醛為唯一碳源的液體培養基中，每48 ～72 h 轉接1 次以保證乙醛的濃度，11 ℃培養14 d。

1.2.4 搖瓶發酵

斜面菌株1 環→10 mL 試管(25 ℃，36 h)→9 mL試管(25 ℃，36 h)→70 mL 麥汁(23 ℃，48 h)→4 ℃冰箱中沉降酵母泥12 h 左右→250 mL 麥汁(500 mL錐形瓶中)，搖勻后上發酵栓，水或濃硫酸密封→11℃發酵6 d→分析乙醛含量

1.2.5 頂空氣相色譜法測定乙醛含量［12］

頂空進樣器平衡溫度70 ℃，平衡時間30 min，傳輸線溫度:130 ℃，進樣時間:0.04 min，進樣口溫度:200 ℃，檢測器溫度:250 ℃，色譜柱初始溫度40 ℃，經程序升溫10 ℃/min 到180 ℃;柱流量1. 2 mL/min，載氣(N2)流量:30 mL/min，燃氣(H2)流量:47 mL/min，助燃氣(空氣)流量:400 mL/min。

2 結果與分析

2.1 致死率曲線

使用15 W 紫外燈，在30 cm 處對打散的酵母菌液進行不同時間的紫外照射，得到酵母的致死情況如圖2 所示。

圖2 不同照射時間下的酵母致死率Fig.2 Lethality of lager yeast strains after UV mutation

采用紫外誘變選育啤酒酵母一般要考慮以下幾方面，首先紫外致死率較低則達不到對啤酒酵母某些發酵性能進行改良的目的，其次較高的致死率又會引起出發菌性能的大幅度改變，會改變成品啤酒的主體風味，因此選擇80%的致死率為最佳，即選擇經紫外誘變27 s 后的菌株進行誘變。

2.2 雙硫侖初篩方法的建立

分別以含雙硫侖濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/L 的培養基培養出發菌，只有雙硫侖為3.5 mg/L 的培養基無酵母長出，所以選取3.5 mg/L為篩選低產乙醛酵母的抗性濃度。將經生理鹽水洗滌后的誘變酵母菌株均勻涂于以乙醇為唯一碳源、雙硫侖含量為3.5 mg/L 的選擇培養基上，28 ℃條件下培養48 ～72 h 后，長出乳白色菌落，如圖3 所示。

同時從上述雙硫侖抗性平板上挑取50 株生長狀態良好的菌落，進行500 mL 三角瓶發酵，發酵結束后考察其乙醛含量，結果如表1 所示。實驗證明經雙硫侖平板篩選的酵母均是乙醛含量降低的菌株，只是乙醛含量的降低幅度有高有低，需要進一步篩選。

圖3 誘變菌初篩結果Fig.3 Screening of mutant strains

2.3 乙醛馴養可行性的驗證

經紫外誘變的酵母分別置于乙醛培養基(乙醛含量為150 mg/L)和普通的麥汁(原麥濃度為11 °P)培養中馴養同樣的時間后，進行三角瓶發酵，考察其乙醛含量。由表2 和表3 可以看出，經乙醛培養基馴養的酵母乙醛下降率(89.5%)要高于普通麥汁馴養的酵母(63.1%)。而且經過乙醛培養基馴養的酵母乙醛含量下降50%以上的占68.4%，而經麥汁培養馴養的乙醛下降50%僅占15%。從而證明酵母通過一定時間的高濃度的乙醛壓力的馴化，提高酵母自身轉化乙醛的能力，使終產物中乙醛的濃度進一步降低。雙硫侖平板與乙醛培養基馴化的結合可以有效的篩選出低產乙醛酵母菌，減少了菌株選育的盲目性。

表2 經乙醛培養基馴養后的酵母發酵情況Table 2 Fermentation of the yeast by directional domestication with acetaldehyde

表3 經普通麥汁培養基馴養后的酵母發酵情況Table 3 Fermentation of the yeast by directional domestication with wort

2.4 菌種的篩選

2.4.1 初篩

挑取雙硫侖抗性平板上的單菌落經活化后，接入帶有發酵栓的500 mL 三角瓶進行發酵，發酵結束后對發酵液中的乙醛進行分析，部分結果如表4 所示。

2.4.2 復篩

從初篩的60 株酵母中選出4 株較優的進一步復篩，將4 株菌在乙醛含量為150 mg/L 的液體培養基中11 ℃傳代生長，低溫既符合啤酒工業生產的發酵環境也保證乙醛的不揮發，同時每48 h 轉接1 次新鮮的乙醛培養基，使菌體始終處在“高滲透壓”的環境下，利于其定向馴化。4 株啤酒酵母經復篩后，搖瓶發酵乙醛含量如表5 所示。

表5 4 株優選菌發酵液乙醛含量Table 5 Acetaldehyde content of four mutants

表5 中4 株啤酒酵母的乙醛含量均可適用于啤酒生產，但是考察1 株啤酒酵母，要綜合多種發酵性能，以保證其可以滿足啤酒實際大生產的需要。綜合啤酒風味、酵母的生長性能、遺傳穩定性等生理生化指標，最終發酵實驗證明D-A-14 更符合啤酒生產的要求，如表6 所示D-A-14 發酵液相對于出發菌MI4而言，高級醇總量降低而酯升高，風味更加協調。同時通過對該株菌的大量實驗發現，該株適合在15 ℃發酵，相對于傳統的11 ℃的低溫發酵，更有利于節能降耗。

表6 出發菌與優選菌的三角瓶發酵指標(mg/L)Table 6 Some indexes with the fermentation of initial strain and mutants (mg/L)

3 結論

采用紫外誘變的處理方式，再經雙硫侖平板初篩及乙醛液體培養基復篩可以有效的得到低產乙醛啤酒酵母，該菌株各項發酵性能良好，遺傳性能穩定，適用于啤酒工業大生產。

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