L-鳥氨酸-阿司匹林復合鹽結晶工藝研究

熊洋，黃志旭，朱超，張建，萬紅貴

(南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京，210009)

L-鳥氨酸是一種非蛋白氨基酸，有很多重要的生理功能，其中最重要的作用是參與尿素循環，另外，它還能保護肝臟、刺激生長激素的分泌、改善睡眠、緩解疲勞、調節脂質代謝等［1］。近年，隨著L-鳥氨酸的保健及醫藥功能的逐漸被發掘，人們對它的研究及新產品的開發逐漸產生了濃厚的興趣，并取得了一定的成果:含L-鳥氨酸的20AA 復方氨基酸制劑不僅能保護肝臟、激發病態下肝臟活力，而且與大劑量VitB6 聯合使用能有效治療多器官功能障礙引起的大出血［2］;L-鳥氨酸-門冬氨酸復合鹽能治療肝性腦病、肝炎以及保護肝臟［3－4］;L-鳥氨酸苯乙酸鹽能有效的降低鳥氨酸循環障礙患者體內的血氨濃度［5－6］;鳥氨酸α-酮戊二酸鹽是很好的臨床營養劑，能促進外科創傷病人的恢復，改善慢性營養不良，改善免疫功能等［7］;鳥氨酸檸檬酸鹽可以改善食品和飲料的口味［8］;此外，L-鳥氨酸與藥物形成的復合鹽能改善藥物在理化性質上的缺陷，如鳥氨酸阿魏酸鹽［9］、奧扎格雷鳥氨酸鹽［10］等的穩定性或水溶性較成鹽前好。研究表明，L-鳥氨酸復合鹽不僅能改善某些藥物的穩定性及水溶性，而且能起到聯合使用相互增強藥效的作用。因此，開發L-鳥氨酸復合鹽具有很高的實用價值。

本文涉及的L-鳥氨酸-阿司匹林復合鹽(L-ornithine-aspirin compound salt，以下簡稱“LOA”)是將L-鳥氨酸與阿司匹林以離子鍵結合形成的結晶產物，與臨床上廣泛使用的賴氨匹林相似，能有效改善阿司匹林的水溶性、穩定性。而L-鳥氨酸能夠促進血脂代謝［1，11］、保護肝臟，這將有利于LOA 用于心腦血管疾病的預防與治療，降低服用阿司匹林引起的肝毒性以及出血癥風險。目前人們對阿司匹林的精氨酸鹽以及賴氨酸鹽研究較多，生產工藝也比較成熟，而關于LOA 制備工藝的研究較少。而結晶過程是LOA 制備工藝中的核心所在，本研究的目的是介紹一種制備結晶型LOA 的方法，并研究了其結晶過程，重點探討了晶種和溶析劑流加情況對結晶質量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

L-鳥氨酸鹽酸鹽 實驗室自制;阿司匹林、乙醇、氨水均為分析純試劑。

BT00 －300M 恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司;RE-52AA 旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;SHB-III 循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;PHS-3C pH 計，海三信儀表廠;JJ-1 精密增力電動攪拌器，常州國華電器有限公司;MasterSizer 2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司;leica DM 1000 顯微鏡，德國萊卡公司。

1.2 測定方法

1.2.1 產品純度測定方法

以LOA 樣品中的鳥氨酸含量計算產品的純度，其中L-鳥氨酸含量測定方法見參考文獻［12］。產品純度計算公式:

式中:ms—樣品總質量，g;mc—樣品中實際測得的鳥氨酸的質量，g。

1.2.2 阿斯匹林含量測定方法

［13］。

1.2.3 普通光學顯微鏡樣品處理方法

取少許樣品于載玻片上，滴加2 ～3 滴無水乙醇在樣品上，放在光學顯微鏡下觀察且拍照，放大倍數為64 倍。

1.2.4 粒度分布測定方法

采用MasterSizer 2000 激光粒度分析儀測定樣品粒度。

1.3 實驗方法

1.3.1L-鳥氨酸鹽酸鹽的脫鹽

將30 g 的L-鳥氨酸鹽酸鹽溶解在1 000 mL 水中，調節pH 到2.0，流過強酸性陽離子交換柱，L-鳥氨酸會與樹脂結合，而Cl－并不在樹脂上保留，而是隨著上柱液流出柱子。用300 mL 水沖洗柱子，洗去樹脂間隙中的Cl－等雜質，再用400 mL 的濃度為2 mol/L 的氨水洗脫，濃縮除氨，得到游離的L-鳥氨酸水溶液。

1.3.2 LOA 粗品的制備

25℃下，取500 mL 濃度為53 g/L 的游離L-鳥氨酸，減壓濃縮10 倍，立即加入150 mL 無水乙醇，攪拌下，將上述L-鳥氨酸的乙醇溶液緩緩加入480 mL 濃度為75 g/L 的阿司匹林乙醇溶液。得到L-鳥氨酸-阿司匹林的白色沉淀，過濾，干燥得L-鳥氨酸-阿司匹林鹽粗品。

1.3.3 LOA 溶解度的測定

維持恒定溫度，溶劑配比以及攪拌速率，讓溶劑與過量的LOA 經過一定時間的混合使其趨于溶解平衡，混合液離心后取上清液，測定其中鳥氨酸的濃度，換算成LOA 的質量即該條件下的溶解度。具體實驗步驟為:配制乙醇與水的混合溶劑，將體系中乙醇的比例記為r，調整混合溶劑中乙醇與水的比例，使r值分別為:100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%;分別加入過量的LOA，攪拌，溶解平衡后，取上清液，樣品用0.25μm 微孔濾膜過濾，濾液稀釋后，測定濃度。

1.3.4 LOA 的結晶

LOA 的間歇結晶過程按照溶析劑加入的量可以分成5 個階段，如圖1 所示。

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 加入結晶器，在適宜恒定的速度下攪拌;25℃下，恒流泵勻速流加乙醇，調整乙醇與LOA 溶液的體積比，添加晶種(將結晶質量較好的LOA 樣品過標準篩，保藏備用，其中本實驗采用125 目的晶種)，攪拌養晶2 h;第III、IV階段分別調整乙醇的滴加速率，使體系維持適宜的過飽和度，以適應晶體的生長;當乙醇與LOA 溶液的比例達到4∶1 時，停止流加乙醇，攪拌養晶，并降溫到10℃;真空抽濾，無水乙醇洗晶3 次，干燥，得到結晶樣品。

圖1 溶析結晶過程示意圖Fig.1 Schematic for dilution crystallization

2 結果與討論

2.1 不同體積比的乙醇/水體系中LOA 的溶解

圖2 為25℃下不同配比的乙醇/水體系中LOA的溶解度曲線。

圖2 25℃時不同配比的乙醇/水體系中LOA 的溶解度曲線Fig.2 Solubility of LOA at different ethanol/water ratio in 25℃

在溶析結晶第I 階段，向60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液中快速流加45 mL 的乙醇，體系中乙醇的比例從0 增加到60%，此時LOA 的溶解度為523 g/L，則此時體系的過飽和度約為ΔC=77 g/L。

在溶析結晶第III 階段，繼續慢速滴加75 mL 乙醇，體系中乙醇的比例為80%，而LOA 的溶解度由523 g/L 降低到150 g/L，流加單位體積的乙醇引起的溶解度改變較大，因此為得到質量較高的結晶產物，需要控制此階段乙醇的滴加速率，以維持體系的過飽和度。

在溶析結晶第IV 階段，較快速度流加120 mL 乙醇，體系中乙醇的比例為89%，LOA 的溶解度由150 g/L 降低到20 g/L。

顯然60% ＜r＜80%時，單位體積乙醇形成的過飽和度較大。從理論上分析，假設在結晶過程中晶體生長速率不變，那么在第III 階段的乙醇流加速率應該最小，以保持體系保持合理的過飽和度，避免引發爆發成核。而為了提高生產效率，則在第I 和第IV階段可以適當加快乙醇流加速率。

2.2 添加晶種的優化研究

在結晶的過程中，向體系加入少量的晶種有利于抑制一次成核并維持適量的二次成核，以提高產品質量。通過控制乙醇加入量，使LOA 溶液達到一定的過飽和度，考察晶種添加時機、晶種添加量對結晶的影響。

2.2.1 晶種添加時機對結晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無水乙醇，當V(乙醇)∶V(LOA 溶液)分別為0.6、0.8、1.0、1.2 時，加入晶種。考察晶種加入時機對結晶的影響，實驗結果如表1 所示。

表1 晶種加入時機對結晶的影響Table 1 The influence of addition time of crystal seeds to crystal

實驗結果表明，若在V(乙醇)∶V(LOA溶液)＞0.8 時加入晶種，最終結晶產品細小且產品純度較低，主要是因為溶液的過飽和度較大，越過介穩區，進入不穩區，造成初級均相成核，瞬間產生大量的晶核;V(乙醇)∶V(LOA溶液)為0.6、0.8 時加入晶種，結晶顆粒較大、產品純度較高，說明加入晶種時溶液形成的過飽和度不高，并且加入晶種會及時降低過飽和度，避免形成初級均相成核現象。然而，過早加入晶種作用不大，故本研究選定V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8 時，為最佳晶種添加時機。

2.2.2 晶種添加量對結晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無水乙醇，當V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8時，分別加入大小為125 目的(約115 μm)晶種。考察0%、2%、4%、6%的晶種加入量對結晶的影響，實驗結果如表2 所示，不同晶種加入量對應的晶體顯微照片如圖3 所示。

圖3 不同晶種添加量得到的晶體照片(64 倍)Fig.3 The picture of crystal with different addition amount of crystal seed (64 times)

表2 晶種添加量對結晶的影響Table 2 Effect of crystal seeds amount on crystallization

實驗結果表明，不添加晶種時，LOA 晶體平均粒徑較小，且產品純度低。這主要是因為不添加晶種時，初級均相成核現象嚴重，易爆發成核，導致晶核數量過多，同時過飽和度也會因此降低較多，使晶體生長動力不足;2%的晶種添加量時，提供的晶體數量少，結晶面積不夠大，而體系的過飽和度較大，易產生初級均相成核，瞬間產生大量的晶核，導致LOA 顆粒細小、產品質量差;4%、6%的晶種添加量時，逐漸增大的晶種量，增加了結晶表面積，確保了結晶顆粒在介穩區內生長，產品平均粒度增大，細晶減少，在4%的晶種添加量時，平均粒度最大，純度最高;6%的晶種添加量，晶體粒度較4%的晶種添加量時小，產品中存在少量細晶，可能是因為晶種數量過大，這雖然能夠控制結晶過程在介穩區內進行，但是過多的晶種會增加晶體與晶體、晶體與攪拌槳、晶體與罐壁的碰撞機會，而且在過飽和度不變的條件下過多的晶種會導致晶體生長推動力下降。故選擇4%的晶種添加量為最優值。

2.3 溶析劑流加速率的優化研究

2.3.1 第III 階段乙醇流加速率對結晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無水乙醇，當V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8時，加入4%的晶種，攪拌養晶2 h，控制第III 階段乙醇流加時間分別為:120 min、240 min、360 min，而第III 階段共需要流加75 mL 乙醇，則對應的乙醇流加速率分別為:0.63 mL/min、0.31 mL/min、0.21 mL/min。

表3 乙醇滴加速率對結晶的影響Table 3 The influence of feeding rate of ethanol to crystal

圖4 不同乙醇滴加速率的晶體照片(64 倍)Fig.4 The picture of crystal with different feeding rate of ethanol (64 times)

在結晶第III 階段流加乙醇時間長短意味著結晶體系中LOA 的過飽和度不同。由粒徑分布圖和晶體照片可以看出，若以0.63 mL/min 流加乙醇，時間較短，體系中LOA 的濃度增值大于結晶速率，過飽和度不斷增加，出現均相成核的機會增多，因此形成的晶體顆粒細小［14］。在0.21 mL/min 的流速下碎晶較少并且粒度分布均勻。但如果過度延長結晶時間，則可能會因晶體之間、晶體與攪拌槳葉之間的碰撞增加而形成細晶。故選擇0.21 mL/min 為乙醇最佳流加速率。

2.3.2 第IV 階段乙醇流加速度對結晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無水乙醇，當V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8時，加入4%的晶種，攪拌養晶2 h，控制第III 階段乙醇流加速率為0.21 mL/min。第IV 階段共需要流加120 mL 乙醇，控制流加時間分別為90 min、150 min、210 min，對應的流速分別為1.3 mL/min、0.8 mL/min、0.57 mL/min，考察第IV 階段乙醇流加速率不同對結晶的影響。

表4 第IV 階段乙醇滴加速率對結晶的影響Table 4 The influence of ethanol velocity of flow to crystal at stage IV

實驗結果表明，第IV 階段乙醇流加速率為1.3 mL/min、0.8 mL/min 時，結晶產物中細小晶體較多，產品純度也較低，主要是因為乙醇流加速率過快，導致過飽和度太大，而晶體生長速率相對較小，來不及消耗產生的過飽和度。而流加速率過低，不利于提高生產效率，故最佳流加速率選擇為0.57 mL/min。

3 結論

本文介紹了L-鳥氨酸-阿司匹林復合鹽的制備方法，重點討論了其溶析結晶過程。由于在結晶的過程中，向體系加入少量的晶種有利于抑制一次成核并維持適量的二次成核，可以提高產品質量。因此，文章重點討論了晶種加入時機以及加入量對結晶的影響。另外，根據乙醇流加量的不同將結晶過程分成了5 個階段，重點研究了對結晶影響較大的第III、IV 階段乙醇流加速率的不同對結晶的影響。結果表明，LOA的最優溶析結晶工藝為:取60 mL 濃度約為600 g/L的LOA 溶液，25℃下，向體系中快速流加無水乙醇，當V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8 時，加入4%的晶種，攪拌養晶2 h;控制第III 階段乙醇流加速率為0.21mL/min，維持6 h;然后加大乙醇流加速率至0.5 mL/min，維持3.5 h;最后攪拌養晶2 h，并將體系溫度逐漸降至10℃。最終產品純度為97.9%，平均粒徑為270.6 μm。

參 考 文 獻

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