蠅蛆殼聚糖的純化及結構性質*

宋春麗，任健1，，馬翠翠1，

1(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，哈爾濱 齊齊哈爾，161006)

2(齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，哈爾濱 齊齊哈爾，161006)

甲殼素是一種自然界生物合成量位居第二的天然高分子聚合物，它的基本結構單位是β-1，4-N-乙酰-氨基葡萄糖。甲殼素的脫乙酰化產物稱為殼聚糖，該物質具有生物可降解性、生物相容性、鎮痛等諸多良好的功能特性，在醫藥、食品、廢水處理等多個行業中廣泛應用［1－2］。目前，主要是以蝦蟹殼為原料生產殼聚糖，但是由于原料受地域和季節影響［3］，因而人工養殖的蠅蛆殼為殼聚糖的生產原料倍受關注，不僅是因為蠅蛆殼的甲殼素含量高(30% ～54.8%)、品質好(色素及鈣鹽含量少)，更重要的是可以減少對環境的污染［4］。

殼聚糖氨基含量和分子質量和相對分子質量對功能性質，如抑菌性等影響很大［5］，本文采用凝膠層析(SephacrylTMS-300)對蠅蛆殼聚糖的進行分級純化，得到不同相對分子質量的組分，并對分離的組分進行紅外光譜分析和X-射線衍射分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與實驗儀器

蠅蛆殼，取自齊齊哈爾市建華區齊佳生態養殖專業合作社;蠅蛆殼殼聚糖，實驗室自制，制備方法見文獻［6］，脫乙酰度為79.45%;SephacrylTMS-300，GE Health 公司;D-氨基葡萄糖，上海伯奧生物科技公司;其余試劑均為分析純。

電熱恒溫水浴鍋(DK-98-Ⅱ型)，天津市泰斯特儀器有限公司;離心機(TDL-5-A 型)，上海安亭科學儀器廠;高效液相色譜儀(Agilent 1200 型)，美國安捷倫;TSK-GEL G-6 000 PWxL 柱、TSK-GEL G-3 000PW xL柱(7.8 mm×300 mm)，上海錦華層析設備廠;X-射線衍射儀(D8-FOCUS 型)，德國布魯克公司;傅里葉變換紅外光譜儀(Spectrum One 型)，美國PE 公司。

1.2 殼聚糖的凝膠層析分離純化

稱取一定量的蠅蛆殼殼聚糖，溶于體積分數1%乙酸溶液中，上SephacrylTMS-300 柱(1.6 cm ×100 cm)分離，采用0.05 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液洗脫，上樣量為15 mL(濃度為5 mg/mL)，流速為0.5 mL/min，每管收集5 mL。

1.3 殼聚糖的純度鑒定

采用高效凝膠滲透色譜法測定。儀器為Agilent 1200，配備示差折光檢測器，層析柱為TSK-GEL G-6 000 PWxL 柱(7.8 mm ×300 mm)與TSK-GEL G-3 000 PW xL 柱(7.8 mm×300 mm)串聯;流動相為水(pH 6.0)，流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量20 μL。

1.4 殼聚糖理論氨基葡萄糖含量及純度的計算

殼聚糖的實測氨基葡萄糖含量的測定:取濃度為0.125 ～1.0 g/L 的標準氨基葡萄糖溶液0.8 mL，加入1 mL 質量分數1 % 間苯二酚水溶液，7.5 mL H2SO4，混勻，沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫，加水至10 mL，混勻。以試劑空白為對照，測定490 nm 處吸光值，得濃度和吸光值的關系曲線。殼聚糖酸水解后測定其氨基葡萄糖含量，測定方法同上。

殼聚糖的純度可以定義為:殼聚糖實測氨基葡萄糖含量與理論氨基葡萄糖含量的比值。理論氨基葡萄糖含量和殼聚糖的純度的計算:

1.5 殼聚糖的相對分子質量測定

采用黏度法測定殼聚糖的相對分子質量。精確稱取恒重的殼聚糖樣品1 g，將其溶于50 mL 乙酸-氯化鈉溶劑中(0.1 mol/L 乙酸;0.2 mol/L 氯化鈉)。采用烏氏黏度計測定25℃時殼聚糖的黏度，然后利用公式計算殼聚糖的相對分子質量。

其中:η 為比濃黏度;ηsp 為增比黏度;ηs 為溶劑黏度;η0 為樣品黏度。

相對分子質量計算公式:

其中:K 和α 是常數，K = 1.424 × 10－3，α =0.96，M為相對分子質量。

1.6 殼聚糖的結構分析

1.6.1 殼聚糖的紅外光譜分析

分別稱取干燥的殼聚糖樣品，KBr 研磨壓片后，采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描分析，掃描范圍400～4 000 cm－1。

1.6.2 殼聚糖的X-射線衍射分析

根據參考文獻［7］，將樣品研磨、烘干、過200 目篩，制片，采用全自動X-射線衍射儀測定。以Cu 靶Kαl(40 kV，20 mA)作為射線源，以4.5°/min 的掃描速率從1°掃描到40°。

2 結果與討論

2.1 殼聚糖氨基葡萄糖含量及純度測定

殼聚糖組分1 和組分2 在TSK 上的色譜分布圖見圖1。

圖1 殼聚糖組分1(A)和組分2(B)在TSK 柱上的色譜圖Fig.1 Molecular weight distribution of two prepared fractions of chitosan on TSK column

從圖1 可以看出，組分1 和組分2 都是單一峰，說明二者相對分子質量分布比較均一，這初步證實了這組分的純度較高。

通過測定殼聚糖理論氨基葡萄糖含量，進而計算殼聚糖的純度。標準氨基葡萄糖濃度與490 nm 的吸光值的關系曲線為y= 0.216 4x－ 0.000 1(R2=0.998 5)，測定殼聚糖組分1 和組分2 的氨基葡萄糖含量，計算得出，殼聚糖組分1 和組分2 的純度分別為98.5%和98.2%。

2.2 殼聚糖相對分子質量的測定

根據殼聚糖黏度與相對分子質量之間的關系計算殼聚糖的相對分子質量，測定組分1 和組分2 的相對分子質量分別為620 和230 kDa。

2.3 殼聚糖組分的紅外光譜分析

殼聚糖組分1 和組分2 的紅外光譜圖見圖2。

圖2 商品殼聚糖和殼聚糖組分1、組分2 的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of two prepared fractions of chitosan and commercial chitosan

從圖2 可以看出，組分1 和組分2 在3 600 ～3 200 cm－1為O—H 的伸縮振動;3 200 ～2 800 cm－1為C—H 的伸縮振動;1 400 ～1 200 cm－1之間出現的C—H 的伸縮振動，這些吸收峰都是糖類的特征吸收峰［8］。組分1 的高頻區吸收峰偏高(2 922.86 cm－1)，這可能是其結晶度低所造成的，結晶度低的原因是脫乙酰度較低。而組分1 在1 564.37 ～1 590.15 cm－1酰胺II 譜帶吸收峰比組分2 弱，說明組分1 的脫乙酰度較低。

與商品殼聚糖的紅外光譜圖比較，組分1 和組分2 均在1 013 cm－1(C6—OH 特征吸收峰)和1 120 cm－1附近(C3—OH 特征吸收峰)有較強的吸收峰，說明三者都是甲殼素的衍生產物。

2.4 殼聚糖組分的X-射線衍生分析

商品殼聚糖和殼聚糖組分1、組分2 的X-射線衍射圖譜見圖3。

圖3 商品殼聚糖(A)和殼聚糖組分1(B)、組分2(C)的X-射線衍射圖譜Fig. 3 X-ray diagram of two prepared fractions of chitosan and commercial chitosan

從圖3 可以看出，組分1 和組分2 的衍射峰與商品殼聚糖的衍射峰位置類似，均在2θ = 10.27°、15.73°、19.84°附近出現。但組分1 和組分2 在2θ=10°左右的衍射峰幾乎消失，說明分子間的作用力比較弱。此外，組分1 在2θ =15°附近的衍射峰較強，在2θ=20°附近的衍射峰很微弱，說明組分1 的結晶度不高，這與紅外分析結果一致;組分2 與商品殼聚糖的曲線類似，在2θ =20°時衍射峰型較尖銳，說明結晶度較高。

3 結論

采用SephacrylTMS-300 分離蠅蛆殼聚糖，得到了相對分子質量分別為230 和620 kDa 的2 個組分。高效液相色譜顯示兩組分均達到了較高的純度。純度分析表明兩組分純度分別為98.5%和98.2%。在紅外光譜圖中2 組分均出現了殼聚糖官能團的特征吸收峰;組分1 結晶度不高，組分2 結晶度較高。

［1］ Aranaz I，Mengíbar M，Harris R，et al. Functional characterization of chitin and chitosan［J］. Current Chemical Biology，2009，3(2):203 －230.

［2］ 滕麗菊，張子勇，唐書澤，等. 殼聚糖的抗菌活性研究［J］. 中國調味品，2008，33(10):48 －51.

［3］ 蔣挺大. 甲殼素［M］. 北京:化學工業出版社，2003，3:246 ～247.

［4］ 賀繼東，夏文水. 工程蠅蛆的開發利用和深度加工［J］． 食品工業科技，2002，23(12):90 －93.

［5］ 王岸娜，王璋，許時嬰. 離子交換層析色譜法分離殼聚糖［J］. 無錫輕工大學學報，2003，22(6):75 －80.

［6］ 馬翠翠，任健. 蠅蛆殼制備殼聚糖的工藝條件研究［J］． 現代食品科技，2013，29 (2):331 －334.

［7］ Yen M T，Yang J H，Mau J L. Physicochemical characterization of chitin and chitosan from crab shells［J］. Carbohydrate Polymers，2009，75 (1):15 －21.

［8］ 姚惠源，胡敏，袁小平，等. 小麥麩皮阿魏酰低聚糖的分離純化與結構分析［J］. 2009，30(3):79 －83.