大豆11S 球蛋白-麥芽糖共價改性及其凝膠流變特性*

李冰，遲玉杰，鮑志杰，孫臨政

(東北農業大學食品學院，教育部大豆生物學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

優良的凝膠特性對大豆蛋白在食品領域中的應用起到了不可替代的作用，如在飲料、湯、醬，這樣的流體或半流體食品中，以及在香腸、丸子、肉類罐頭，這樣的固體或半固體中。而大豆蛋白在膠凝過程中的流變特性對食品最終優良的理化及凝膠特性的形成至關重要。大豆蛋白的膠凝過程是溶液體系由液態到半固態(或固態)轉變的過程。動態旋轉流變儀對待測樣品進行小振幅震蕩，即施加交變應力，通過測量參數(彈性模量G’及黏性模量G”)的反饋來檢測蛋白質凝膠的形成過程［1］。

為滿足食品領域對于具有專項高凝膠型產品的需求，常采用特定方法對大豆分離蛋白進行改性，其中糖基化反應是目前眾多改性方法中較為理想的一種［2］。糖基化改性是基于一種自發反應，不需要額外添加任何化學試劑，通過加熱就可以很大程度地加速該反應的進程［3］。大豆分離蛋白根據沉降系數的不同可將其分為2S、7S、11S 和15S 4 種組分，其中7S 組分占30%以上主要由7S 球蛋白組成，11S 組分占40%以上由單一的11S 球蛋白構成［4］。7S、11S 組分對凝膠的形成及其性質起主要的作用，朱建華［5］等人采用小變形振蕩流變手段研究了葡聚糖分子質量對大豆7S 蛋白凝膠的影響，結果表明，熱致大豆7S 蛋白凝膠的黏彈性質隨所添加的葡聚糖分子質量的增加而增加;許彩虹［6］等將3 種不同分子量葡聚糖與β-伴大豆球蛋白進行干熱反應，得出以共價鍵結合的葡聚糖能夠和蛋白質分子均勻的分布在凝膠網絡結構中，不會引起相分離。故而以提高大豆分離蛋白凝膠特性為目的，針對主要組分的糖基化改性研究具有深遠意義。

本實驗在前人［2］研究基礎上，選用麥芽糖對大豆11S 球蛋白進行糖基化濕熱改性，Box-Behnken 模型進行工藝優化，并運用流變學手段對糖基化產物膠凝過程進行監測分析，旨在尋找到一種有效提高凝膠特性并適合工業化生產的改性方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕，哈高科大豆食品有限公司提供，經粉碎，過60 目篩得到脫脂豆粉;麥芽糖，天津市天理化學試劑有限公司;其他化學試劑均為國產分析純。

飛鴿TGL-16aR 高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG-9023A 型)，上海森信實驗儀器有限公司;FDU-1100 型冷凍干燥機，日本Tokyo Rikakikai 公司;Bohlin Gemini2 旋轉流變儀，英國Malvern 公司;TA. XT. Plus 質構儀，Stable Micro system Ltd。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆11S 球蛋白分離純化

根據Nagano 法［7］從低溫脫脂豆粕中提取大豆11S 球蛋白，冷凍干燥后備用。

1.2.2 糖基化蛋白樣品的制備

將不同質量的麥芽糖溶解于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，再與純化后的11S 球蛋白混勻制成100 g/L 蛋白濃度的混合物，保鮮膜封口置于一定溫度的水浴中，反應一定時間后立即取出，冷卻至室溫，凍干后得到11S 球蛋白-麥芽糖糖基化產物。

1.2.3 糖基化蛋白凝膠的制備與測定［8－9］

將糖基化改性后的混合粉溶解于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，蛋白含量(以11S 蛋白計)120 g/L，充分攪拌3 h 后，于4℃下冷藏過夜確保蛋白質充分水化，測定操作參照劉燕［10］等人的方法。

1.2.4 糖基化蛋白凝膠流變性質的測定

采用馬爾文旋轉流變儀對樣品進行測定，樣品制備參照1.2.2 方法。測定時取待測樣品置于60mm平行板間，調節間距為0.5 mm，小心擦去過量樣品，在樣品裸露部分滴加一層薄硅油以防止加熱過程中水分的蒸發。采用動態振蕩模式，平衡溶液溫度30 s后自25℃升溫至90℃，恒溫30 min 后降溫至25℃，整個過程升降溫速率設為2℃/min，保持頻率0.1Hz，固定形變0.01。記錄此過程待測樣品的彈性模量(G’)及黏性模量(G”)隨時間變化的趨勢［11］。

1.2.5 響應面設計方案

在單因素實驗的基礎上，考慮到實際生產要求，以麥芽糖添加量(X1)、反應溫度(X2)、反應時間(X3)為自變量，11S 球蛋白凝膠強度(Y)為響應值，采用響應面分析方法進行優化，試驗設計因素水平見表1。

表1 試驗因素水平表Table 1 Experiment design for levels of factors

2 結果與討論

2.1 大豆11S 球蛋白與麥芽糖糖基化反應的單因素試驗

2.1.1 麥芽糖添加量(X1) 對凝膠強度的影響

由圖1 可知，在相同的反應溫度、反應時間下，糖基化產物凝膠強度隨著麥芽糖添加量的增加而呈先上升后下降，最終趨于平緩的變化趨勢，當麥芽糖添加量為2%時，所得產物凝膠強度最高，這可能是因為糖的接入使蛋白質結構展開，疏水作用力增強。隨后的下降趨勢可能是因為生成的糖基化產物溶解性差，導致凝膠強度下降。當麥芽糖添加量超過3%時，糖基化反應趨于飽和，凝膠強度基本不變。

圖1 不同麥芽糖添加量對凝膠強度的影響Fig.1 Effect of adding contents of maltose on gel strength

2.1.2 反應溫度(X2) 對凝膠強度的影響

從圖2 可以看出，在相同的麥芽糖添加量、反應時間條件下，產物凝膠強度隨著反應溫度的升高呈先上升后下降的變化趨勢，當反應溫度為70℃時所得產物凝膠強度最高。分析原因可能是由于加熱初期大豆球蛋白空間結構受熱展開，暴露出了原本埋藏在結構內部的疏水性氨基酸殘基及巰基［12］，導致蛋白質表面疏水性發生變化;而隨著反應溫度的繼續升高，一方面蛋白和麥芽糖反應劇烈，生成的麥芽糖-蛋白復合物不易溶解;另一方面，蛋白間通過S-S 發生聚集，形成粗糙、富含不溶物的凝膠，從而使凝膠的強度有所下降。

圖2 不同反應溫度對凝膠強度的影響Fig.2 Effect of different reaction temperature on gel strength

2.1.3 反應時間(X3) 對凝膠強度的影響

如圖3 所示，在相同的麥芽糖添加量、反應溫度條件下，產物的凝膠強度隨著反應時間的增加呈先上升后下降的變化趨勢，當反應時間為50 min 時所得產物凝膠強度最大。大豆球蛋白反應活性隨著反應時間的增加而逐步提高，但達到某一時刻，蛋白質分子內或分子間的巰基會交聯形成S-S，使蛋白質間彼此聚集，溶解性降低，凝膠強度下降。

圖3 不同反應時間對凝膠強度的影響Fig.3 Effects of different reaction time on gel strength

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 糖基化反應模型的建立

按照試驗設計方案進行試驗，結果見表2。

表2 響應面試驗設計條件及結果表Table 2 Design and results of response surface experiment

應用Design Expert7.1 軟件，對表2 中的數據進行多元回歸擬合，可得麥芽糖添加量(X1)、反應溫度(X2)、反應時間(X3)與11S球蛋白凝膠強度(Y)的二次多項回歸方程:

Y1= 267.5 － 21.97X1－ 17.76X2－ 1.62X3－27.63X1X2+ 0.7X1X3+ 17.81X2X3－ 60.02X12 －

表3 11S 球蛋白凝膠強度的方差分析Table 3 Variance analysis of gel strength of 11S globulin

由表3 的方差分析可以看出，11S 球蛋白凝膠強度回歸方程模型F 檢驗顯著(P＜0.05)，失擬P值為0.491 4 大于0.05，失擬項不顯著，說明回歸方程的擬合程度較好，試驗誤差較小。同時，模型的決定系數R2=0.987 6，說明98.76%的變更可通過該模型解釋;模型的調整決定系數是0.971 7，說明該模型可以解釋97.17%的影響值變化，進而表明此模型擬合度高，可用于預測和分析不同反應條件下，糖基化復合物的凝膠特性及對反應條件的優化［13］。

2.2.2 響應面的優化

根據試驗結果，經回歸分析，得到各因素對凝膠硬度影響的響應曲面圖，并確定最佳因素水平，結果如圖4 所示。

利用軟件Design Expert 7.1 對糖基化改性工藝進行優化，以糖基化11S 球蛋白凝膠強度為指標，當麥芽糖添加量為1.85%，反應溫度68.42℃，反應時間50.08 min 時，凝膠強度可以達到269.43 g。根據實際情況，將麥芽糖添加量設定為2.0%，反應溫度設定為70℃，反應時間設定為50 min，在此條件下進行了3 次驗證試驗(數據未顯示)，取平均值，得到結果為270.52 g，相對偏差0.4%，表明Box-Behnken 模型可用于大豆球蛋白-麥芽糖糖基化反應條件的優化。且與未改性11S 球蛋白相比，共價改性的11S 球蛋白凝膠強度提高了20.7%，表明糖基化有效的提高了蛋白的凝膠特性。

2.3 大豆11S 蛋白及其糖基化產物凝膠流變學性質

圖4 凝膠強度影響因素的響應面分析Fig.4 Response surface analysis of influencing factors for gel strength

2.3.1 小振幅動態測試

檢測物質的膠凝過程通常采用動態流變學手段［14－15］。動態測試中有2 個獨立參數，彈性模量G’和粘性模量G”，在凝膠形成過程中分別反映彈性性質和粘性性質，對于典型的凝膠體系，G’和G”相互平行，前者大于后者［6］。

圖5 所示為大豆11S 球蛋白及其糖基化產物G’和G”隨時間變化的趨勢。從圖5 中可以看出溫度掃描開始時，大豆11S 球蛋白的G’和G”均處于較低水平(＜10Pa)，體系以液態為主。當升溫至90℃左右時，大豆11S 球蛋白G’和G”突然增長，當G’＞G”時(90℃持續加熱10 min 后即2 648 s 處)出現凝膠點(當聚集的蛋白質從黏性的流體轉變為彈性的凝膠，在流變學中，該轉變點被稱為凝膠點，相對應的溫度被稱為凝膠溫度。而事實上G’和G”的交叉點也被定義為凝膠溫度Tg［16］)，說明樣品溶液已經開始從以液體性質為主的溶膠狀態轉變為以固體性質為主的凝膠狀態，這是由于蛋白質受熱變性，不久后形成了初步的網絡結構所致［17］。

圖5 11S 及其糖基化產物的G’和G”隨凝膠加熱時間的變化Fig.5 Dependence of Storage G’(open symbols)，loss G’’(filled symbols)module and temperature on time for glycinin and glycated products

糖基化蛋白的G’和G”變化規律與11S 球蛋白單獨體系相類似，11S-麥芽糖糖基化產物溶液在溫控初始階段的彈性模量G’和黏性模量G”值略高于大豆11S 球蛋白單一體系，說明體系中糖分子的接入，提高了大豆11S 蛋白溶液的黏彈特性，使此時的蛋白樣品具有一定的弱凝膠性。隨著對糖基化產物蛋白體系的進一步加熱，溫度升至83℃左右時，糖基化產物彈性模量G’和黏性模量G”驟然升高，在G’＞G”時(90℃持續加熱8 min 后即2 489 s 處)出現凝膠點，表明樣品溶液已開始從液體狀態轉變為以固體狀態為主的凝膠態。

在90℃恒溫階段，糖基化產物凝膠黏彈性較11S單一體系顯著提高，這是因為糖基化反應使得體系中引入了麥芽糖分子即大量羥基，分子間氫鍵的形成機會大大增加所致。在此階段，11S 球蛋白結構充分展開，凝膠網絡初步形成。之后的降溫階段，蛋白G’和G”上升平緩且趨于平行，說明體系已形成了較穩定的凝膠網絡結構。

3 結論

(1)利用Box-Behnken 模型對大豆11S 球蛋白與麥芽糖糖基化反應進行了優化，方差分析表明擬合較好。優化后的工藝條件為麥芽糖添加量1.85%，反應溫度68.42℃，反應時間50.08 min，凝膠強度可達269.43 g。根據實際情況，將麥芽糖添加量設定為2.0%，反應溫度70℃，反應時間50 min，此條件下驗證結果為270.52g，相對偏差為0.4%，且與未改性11S 球蛋白相比，凝膠強度提高了20.7%。

(2)采用旋轉流變儀對大豆11S 球蛋白及其糖基化產物的凝膠形成過程進一步分析得出:在整個溫度掃描過程中，大豆11S 糖基化產物凝膠的粘、彈性均大于大豆11S 球蛋白單一體系，宏觀表現為具有較好的凝膠特性，且相比于黏性模量G”，其彈性模量G’增長較快，凝膠形成點有所提前(即從2 648 s 提前到2 489 s)，說明糖基化反應使得大豆11S 球蛋白形成了硬度較高的凝膠結構，此結果與凝膠質構分析結論相一致。

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