鮮切結球萵苣中單增李斯特菌生長預測模型的建立*

張引成，尹曉婷，雷云，韋瑩瑩，潘磊慶，屠康

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京，210095)

單核細胞增生性李斯特菌屬于李斯特菌屬，可在極端的環境中生長和存活，耐高鹽環境，能忍受冷凍和干燥［1］，能在冷藏溫度下繁殖的致病菌，對低溫有較強的耐受性，(4 ±2)℃條件下仍能生長繁殖，－20℃低溫下可部分存活，對熱的抵抗力較弱，60 ℃、30 min 可滅活。近幾年我國檢疫人員對國內不同地區的各類食品進行了抽樣檢測，其中生鮮蔬菜中單增李斯特菌檢出率高達16%［2－5］。

結球萵苣是蔬菜沙拉中最主要的一種配菜，常單獨或同其他蔬菜在一起包裝，即開即食，在過去的10年中，其市場份額占鮮切蔬菜產品總量的80%［6］。然而，蔬菜組織由于被切割后汁液外滲，很容易感染單增李斯特菌，從而引發食源性疾病，增加了食品安全風險。預測食品微生物學(predictive food microbiology)作為保證食品微生物安全方面的基礎研究，旨在以計算機為基礎，描述特定環境下各種微生物的行為，借此數量化預測細菌的生長、殘存、死亡情況。預測微生物學的研究模式包括3 個層次:初級、二級、三級，其具體表現為:微生物生長過程與時間的關系、考慮了環境因素之后的微生物生長模型、計算機軟件程序或稱專家系統的建立［7］。為探討該菌在鮮切結球萵苣貯藏期間的消長規律，本文主要研究在4、8、16、24、32 ℃5 個不同貯藏溫度下，鮮切結球萵苣中單增李斯特菌數量的動態變化，采用DPS (data processing system)統計分析軟件，建立了相應的初級和次級函數模型。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

結球萵苣，購買于南京紫金山附近菜園，為了充分去除田間熱，萵苣經采收后迅速進行預冷處理。挑選顏色翠綠且完整、無病蟲害和機械損傷的葉片，清洗干凈后通風處晾干，用鋒利不銹鋼刀切割出10 g 葉片，紫外線下正反面各滅菌20 min 后保存于培養皿中。

單增李斯特菌(CICC 21662)，中國工業微生物菌種保藏管理中心;PALCAM 瓊脂，北京陸橋技術有限責任公司;高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司;生化培養箱，南京貝帝實驗有限公司;酸度計，上海精密科學儀器有限公司;電子天平，上海奧豪斯有限公司;移液器，北京青云卓立精密設備有限公司;生物安全柜，上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 接種液的制備

菌種活化后，將單增李斯特菌菌液，用劃線法接種于胰酪胨大豆酵母肉湯瓊脂(TSA-YE)平板上進行培養，37 ℃下培養24 h，觀察培養結果，然后挑取典型菌落接種入TSB-YE 培養液中，37℃下培養18 h，此時菌液濃度約為108CFU/mL 左右，用滅菌的生理鹽水適當稀釋，使菌液濃度為103CFU/mL，即得接種液。

1.2.2 單增李斯特菌的接種

用移液器取0.1 mL 單增李斯特菌接種液至10 g經過滅菌的結球萵苣頁面表面，分別置于4、8、16、24、32 ℃恒溫生化培養箱中培養，每隔一段時間，取出樣品，放入90 mL 無菌生理鹽水中，充分震蕩搖勻，用移液器取出0.1 mL 稀釋液至PALCAM 瓊脂上，進行涂布，涂布后的PALCAM 瓊脂平板倒置于37℃恒溫培養箱培養24 h 后，進行菌落計數。

1.3 數學模型的建立與驗證

1.3.1 初級預測模型的建立

首先對單增李斯特菌的生長曲線進行擬合，按照Zwietering 等［8］人修正的Gompertz 模型，估計生長曲線的最大比生長速率(growth rate，μmax)和遲滯時間(lag time，λ)。

式中:t，時間(h);λ，遲滯時間(h);Nt，t時的菌數(CFU/mL);N0，初始菌數(CFU/mL);Nmax，最大菌數(CFU/mL);μmax，最大比生長速率(h－1)。

應用Excel 2003 統計所有數據，應用SAS8.2 統計分析軟件進行方差分析(ANOVA)和顯著性檢驗，對SigmaPlot 10.0 中Gompertz-four factors 模型稍作修改，對上述的Gompertz 方程進行擬合，并繪圖，建立初級生長模型。

1.3.2 二級預測模型的建立

溫度對單增李斯特菌生長動力學的影響可以建立二級模型進行研究，由Bělehrádek 開創［9］、Ratkowsky［10］等改進的平方根模型可以簡單有效地描述溫度與微生物生長參數之間的關系:

式中:μmax，生長速率(h－1);λ，遲滯時間(h);T，溫度(℃);bmax、bλ，待估回歸系數;Tmin，是通過外推回歸線與溫度軸相交而得到的溫度，是一個假設溫度，指的是在此溫度條件下微生物沒有代謝活動。

將(1)中得到的生長速率μmax和其所對應的溫度分別代入(2)(3)2 個方程式，得出bmax、bλ、Tminμ和Tminλ值。將所得參數值代回原等式，即可得到溫度對于最大比生長速率的影響。

1.3.3 模型的可靠性評價

根據Ross［11］與Mellefont［12］等提出的準確因子(accuracy factor，Af)和偏差因子(bias factor，Bf)來評價已經建立的單增李斯特菌生長動力學預測模型的可靠性。準確因子和偏差因子用下式表示:

式中:pred，預測值;obs 為，實測值;n，試驗次數。

(1)當Bf＜0.70 或Bf＞1.15，此時模型不可靠，不能用于模擬描述微生物生長等狀況;

(2)當0.70 ＜Bf＜0.90 及1.06 ＜Bf＜1.15 之間時，模型的精確度可以接受，但誤差較大;

(3)當0.90 ＜Bf＜1.05 之間時，模型準確因子高，誤差小。

但系統偏差(systematic deviation)不能由Af和Bf描述，而可用預測值和觀察值的殘差分析［13］來揭示，所建立的預測模型的殘差值越小，表明模型的準確性越高。因此，本文選用準確因子(Af)、偏差因子(Bf)和殘差分析對所建立的數學模型進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 初級預測模型的建立

根據4、8、16、24、32 ℃單增李斯特菌在鮮切接球萵苣上生長試驗觀察值，選用修正的Gompertz 方程回歸描述單增李斯特菌的生長動態。試驗觀察值和擬合曲線如下:

根據擬合曲線，鮮切結球萵苣中單增李斯特菌在不同溫度下的生長，用修正的Gompertz 模型回歸得到的方程如下，表1 為其具體的生長動力學參數:

表1 不同溫度下單增李斯特菌在鮮切結球萵苣中的生長動力學參數Table 1 The parameters growth rate(μmax)and lag time(λ)of L. monocytogenes obtained from Gompertz function

logN(t)=3.115 +1.787 ×Exp{－Exp［0.086 ×(99.773 －t)+1］} 4℃

logN(t)=3.120 +1.997 ×Exp{－Exp［0.052 ×(55.511 －t)+1］} 8℃

logN(t)=3.172 +3.148 ×Exp{－Exp［0.069 ×(12.458 －t)+1］} 16℃

logN(t)=3.188 +3.546 ×Exp{－Exp［0.134 ×(4.592 －t)+1］} 24℃

logN(t)=3.019 +4.391 ×Exp{－Exp［0.213 ×(3.325 －t)+1］} 32℃

圖1 不同溫度下單增李斯特菌在鮮切結球萵苣中的生長擬合曲線Fig.1 Curve of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce at different temperatures

2.2 二級預測模型的建立

由圖2 可以看出，溫度與(μmax)0.5和(1/Lag)0.5呈現較好的線性關系，2 種模型中的R2分別為0.977 2和0.984 7，溫度與Lag、μmax 的平方根方程為:

2.3 模型的可靠性評價

分別在4、8、16、24、32℃下，在8 個隨機時間點(單位:h)進行模型的驗證實驗，測定該時間點的菌數值，并將實驗測定的值與該點模型的預測值比較，進行殘差分析和準確因子及偏差因子分析。

不同溫度下幾個隨機點的實測值和預測值見表2。

圖2 單增李斯特菌在鮮切結球萵苣中的二級模型生長曲線:(A)μmax1/2 －T;(B)(1/lag)1/2 －TFig.2 Secondary model of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce

表2 李斯特菌在不同溫度下擬合Gompertz 模型的幾個隨機點的實測值和預測值Table 2 The observations and predictions of L. monocytogenes at different temperatures

2.3.1 殘差分析

為了驗證預測值與實驗值的差異性，進行了殘差分析實驗，實驗結果見圖3。由4、8、16、24、32℃下殘差分析圖，可直觀地看出，每個溫度下預測值與實驗值之差均在±0.1 之間，說明所建立的預測模型在α=0.1 的水平上是可信的。

2.3.2 準確因子和偏差因子驗證

本試驗的研究結果表明，各組偏差因子Bf值都在0.90 ～1.0，由1.3.3 中可靠性評價方法知，本試驗的模型屬于最好類型。

圖3 不同溫度下預測值與實測值的殘差分析圖Fig.3 The residuals of L. monocytogenes grown at different temperatures

在進行數學檢驗［14］的時候，由于偏差因子不能表示參數估計的平均準確性(average accuracy of estimates)，因此常結合準確因子(Af)來進行分析，Af值越大表示平均值準確性越低，而Af值等于1 表示預測值與觀測值之間完全吻合(perfect consistency)［15］。

如表3 所示，預測值的上下波動幅度和誤差均較小(＜1.80)［16］，說明所建立的生長預測模型能很好地預測單增李斯特菌在4 ～32℃下的生長狀況。

表3 在4、8、16、24、32℃下L.M 在鮮切結球萵苣中生長預測值的偏差因子和準確因子Table 3 Mathematical validations of secondary model of L. monocytogenes grown on fresh-cut iceberg lettuce

3 結論

本文用修正的Gompertz 方程擬合了不同溫度下單增李斯特菌在鮮切結球萵苣上的生長情況，溫度對μmax和λ 的影響，采用次級平方根模型進行描述，以下為基于鮮切結球萵苣二級模型:

二級模型為線性方程，方程的R2為0.977 2 和0.984 7，呈現良好的線性關系。由此可知，所建立的預測模型能很好地描述不同溫度下單增李斯特菌的生長動態。本研究通過向鮮切蔬菜上接種單增李斯特菌來獲得生長數據從而建立模型，這種方法雖然操作煩瑣，但將食品原料組織對特定微生物生長的影響考慮在建模范圍內，所建立的模型能較好地預測特定微生物在食品上的實際生長情況。

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