保加利亞乳桿菌LJJ 自溶的影響因素分析*

崔文明，劉鷺，張書文，逄曉陽，李紅娟，呂加平

(中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京，100193)

乳酸菌自溶現象在乳酸菌發酵制品中普遍存在，是菌體自發進行的細胞溶解現象，被認為是細菌在不利環境中維持自我菌群生存的一種保護機制［1］。細菌自溶與自溶酶密切相關，通常認為自溶是由細菌內自溶酶的失衡作用所引起。自溶過程中自溶酶對細胞壁的水解作用會導致細胞壁破裂而出現孔洞，致使細胞質內容物流失［2］。

乳酸菌自溶過程中釋放的胞內蛋白酶、肽酶、酯酶等酶類，可將蛋白、多肽和脂肪分解成不同的風味物質或風味前體物質，從而形成發酵制品的特殊風味和口感［3］。一般情況下，發酵劑菌株自溶對發酵制品的品質形成起著積極作用。以干酪生產為例，比較高自溶菌株Lactobacillus lactissubsp．cremorisAM2 與低自溶菌株Lactobacillus lactissubsp．cremorisHP 生產的切達干酪品質后發現，前者沒有苦味且風味濃郁，而后者則苦味明顯，且風味物質種類顯著少于前者［4］。由于干酪成熟過程中產生的良好風味主要依賴于乳酸菌自溶所釋放酶的水解作用，所以釋放酶的種類及數量將決定著干酪成熟周期長短和風味優劣［5-6］，表明發酵劑菌體快速自溶在一定程度上有利于促進干酪成熟。然而，當發酵劑菌體自溶速率過快時，會導致發酵制品產酸不足、凝乳不良及乳糖殘留過多等問題而影響產品的品質和得率［7］。

鑒于乳酸菌自溶在發酵乳制品中的普遍性、重要性，而自溶酶調控自溶的相關機制尚不清晰的現狀，本研究主要以保加利亞乳桿菌LJJ 菌株為研究對象，考察菌體溫育溫度、溫育時間、環境pH、菌體生長階段、SDS 濃度，Triton X-100 濃度對菌體自溶特性及溶菌酶活性、自溶過程的菌體形態變化的影響規律，以期初步解釋乳酸菌自溶的誘發原因和自溶規律，為更進一步探討乳酸菌的自溶機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp．bulgaricus)LJJ(本實驗室分離保存);EDTA，HCl(分析純，國藥化學試劑有限公司)、十二烷基磺酸鈉(SDS)(分析純，北京拜爾迪生物有限公司)、Tris Base(Angus Chemical Company)、MRS 培養基(北京陸橋技術有限責任公司)，溶菌酶檢測試劑盒(南京建成生物有限公司)。

1.2 儀器與設備

AUW220 電子天平，日本 Shimadzu 公司;UV2300 分光光度儀，上海天美科學儀器有限公司;DHP-9082 型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司;DL-CJ-IN 高性能無菌試驗臺，哈爾濱市東聯公司;LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;JY92-ⅡN 超聲波細胞破碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;S-3400N 型掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 方法

1．3．1 菌株保藏及培養基制備

保存于-20℃冰箱的凍干菌粉，經MRS 液體培養基于37℃條件下活化3 次以上，然后儲存于4℃冰箱備用。MRS 液體培養基按照商品說明書所示比例配制，115℃滅菌20 min。

1．3．2 菌體培養、收集、洗滌及重懸

經活化的實驗菌株培養至對數生長期后，以4%(v/v)的接種量接種于MRS 液體培養基，37 ℃下培養至目標菌體濃度后，離心(5 000 r/min，4℃，10 min)收集菌體。無菌生理鹽水懸浮洗滌菌體，重復洗滌3 次，無菌備用TE 緩沖液(50 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA)洗滌菌體1 次，懸浮收集菌體于適當pH 的上述TE 緩沖液，備用。

1．3．3 自溶度的檢測方法

LJJ 菌懸液(OD600nm=0．4 ～0．6)，取適量去除菌體，測定上清液OD260nm，讀數記為A0。另取適量上述菌懸液置于培養箱溫育t h 后，取樣去除菌體，測定上清液OD600nm，讀數記為At。超聲波冰浴破碎(400 W，工作3 s，間隙3 s)剩余菌懸液至透明(表明菌體完全破碎)，取樣去除菌體，測定溶液OD260nm，讀數記為As。菌體自溶度計算:

1．3．4 菌體生長階段對其自溶度的影響

分別選取來自對數生長初期、中期、末期，生長穩定期和生長末期的菌體細胞，重懸于pH 8．0 的緩沖液中于37℃下振蕩溫育24h，測定其自溶度。

1．3．5 不同pH 對菌體自溶度的影響

洗滌菌體分別重懸于pH 為2．0，4．0，5．0，6．0，7．0，8．0，10．0 的洗滌緩沖液中，于37℃，振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．6 溫度對菌體自溶度的影響

取對數生長期的菌體細胞，重懸于pH 8．0 的洗滌緩沖液中，分別置于4，25，37，50，60 和70℃環境中振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．7 SDS 濃度對菌體自溶的影響

取對數生長期菌體細胞重懸于pH 8．0 的洗滌緩沖液中，懸浮液中分別添加SDS 至終濃度為0．10，0．25，0．50 及1．00 g/L，置于37℃下振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．8 Triton X-100 濃度對菌體自溶的影響

取對數生長期菌體細胞，重懸于pH8．0 的洗滌緩沖液中，懸浮液中分別添加Triton X-100 至終濃度為0．25，0．50 及1．00 g/L，置于37℃下振蕩溫育，測定其自溶度。

1．3．9 掃描電鏡觀察

收獲處于對數生長期的菌體細胞，生理鹽水洗滌3 次，TE 緩沖液洗滌1 次后，取部分細胞，重懸浮于電鏡樣品固定液，備用。剩余樣品取一部分添加終含量0．50 g/L 的SDS 與剩余部分樣品置于37℃培養箱孵育24 h 后，離心收集菌體，重懸于電鏡樣品固定液。將正常細胞，24 h 自溶細胞和SDS 自溶細胞制備電鏡樣品后，置于掃描電鏡下觀察。

1．3．10 溶菌酶活力檢測

采用比濁度法，參見試劑盒使用說明書。

1．3．11 數據處理與分析

應用Statistics Analysis System(SAS)9．2 進行單因素方差分析，P＜0．05 視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同生長階段LJJ 菌株自溶度的變化

圖1 結果顯示，隨著LJJ 細胞的不斷增殖，細胞自溶度逐步降低(未包括遲滯期，0 ～2 h)。對數生長期(4 ～14 h)細胞具有最大的自溶度，約為70．0%，整個對數生長期階段，生長中期(10 ～12 h)的細胞自溶度略高，但對數生長期內細胞自溶度間無在統計學意義上的顯著性差異(P＞0．05)。穩定期(20 ～32 h)細胞自溶度次之，約為43．0%，極顯著低于對數生長期自溶度(P＜0．01)。衰退期(36 ～45 h)細胞自溶度最低，一般低于20．0%且隨著時間的延長自溶度逐漸降低。來自對數生長期與穩定期過渡區間(16 ～18 h)和穩定期與衰退期過渡區間(32 ～34 h)的LJJ 細胞自溶度分別介于43．0% ～60．0% 和20．0% ～43．0%，且與來自對數生長期，穩定期，衰退期的LJJ 細胞自溶度之間存在顯著性差異(P＜0．01)。

2.2 不同pH 對LJJ 菌株自溶的影響

研究結果表明，LJJ 菌株發生自溶的最適pH 為6．0 ～8．0。菌體自溶與環境pH 值關系密切，低酸性環境可顯著抑制乳酸菌的自溶。自溶8 h 時，LJJ 菌體自溶度隨著環境pH 升高而增大，彼此間差異顯著(P＜0．01)。自溶持續發生24h 時，除pH 5．0 菌懸體系的自溶度較低外，其余體系的自溶度開始趨于一致。當自溶時間延長至96h 時，pH 6．0 環境體系中菌體自溶度反而高于pH 8．0 和pH 7．0 環境體系中的菌體自溶度(圖2 A)。環境pH 大于8．0 時，LJJ 自溶受到部分抑制，當pH 大于或等于10．0 時，自溶受到顯著(P＜0．01)抑制(圖2B)。

圖1 來自不同生長階段的LJJ 菌株自溶度的變化Fig．1 The autolysis rate of LJJ from different growth phases

2.3 孵育溫度對LJJ 菌株自溶的影響

由圖3A 中所示，0 ～50℃，在相同溫育時間下，LJJ 的自溶度隨溫度升高而增大，同時到達自溶度趨于穩定所需的時間也隨著溫度的升高而縮短。其中，環境溫度50℃時，96h 時的自溶度為90．6%，為4 個溫度水平中的最大自溶度，而且在12h 已基本達到最大，此時自溶度為81．3%顯著高于37℃時的46．8%(P＜0．01)。而圖3B 顯示，當溫度升高至60℃以上時，LJJ 自溶度開始隨著溫度的升高而降低。

2.4 SDS 對LJJ 自溶的抑制作用

圖3 溫度對乳酸菌自溶的影響Fig．3 Effects of incubation temperature on the autolysis of LJJ

當環境中存在SDS 時，LJJ 的自溶受到抑制。環境中SDS 濃度為0．10 g/L 時，乳酸菌自溶度即降為空白對照的約62．0%，且隨著懸浮體系中SDS 含量的增加，乳酸菌的自溶度逐漸降低，當環境中SDS 濃度為0．50 g/L 時，乳酸菌的自溶幾乎被完全抑制，此時自溶度僅為對照的0．03%。因此，SDS 是乳酸菌LJJ 自溶的較強抑制劑(圖4A 所示)。如圖4B 所示，與商品溶菌酶試驗組對比，SDS 對商品自溶酶的抑制效果與LJJ 自溶抑制基本完全對應，表明SDS 對LJJ自溶的抑制可能是通過抑制其自溶酶活性而實現的。

2.5 Triton X-100 對LJJ 自溶的影響

研究結果如圖5 所示，Triton X-100 的存在可促進LJJ 自溶的發生并增強溶菌酶的活性，且隨著Triton X-100 濃度的增大，菌體自溶增速和酶活增強作用越明顯。當環境體系中Triton X-100 添加量為1．0 g/L 時，LJJ 的自溶度相比對照增大了20．7%(溫育24h)(圖5A)，而溶菌酶的活性與空白對照相比提高了39．5%。比較圖5A 和圖5B，發現Triton X-100對溶菌酶酶活性的增強效果與加速LJJ 自溶的效果基本趨于一致。

2.6 掃描電鏡觀察LJJ 自溶中的細胞形態變化

圖4 SDS 濃度對LJJ 自溶與溶菌酶活力的影響Fig．4 Effects of SDS concentration on the autolysis of LJJ and lysmozye activity

圖5 Triton X-100 對LJJ 自溶和溶菌酶的影響Fig．5 Effects of Triton X-100 concentration on the autolysis of LJJ and lysmozye activity

對數生長期收獲的LJJ 菌體細胞，菌體完整飽滿，表面光滑(圖6A);而將正常LJJ 細胞于TE 緩沖液(pH8．0)中37℃下溫育24 h 后，LJJ 細胞的完整性遭到破壞，細胞發生不同程度的萎縮和凹陷，而且在細胞表面出現孔洞(圖6B)，胞內內容物也開始逐步釋放至周圍環境中。相同TE 緩沖液中添加終濃度0．50 g/L 的SDS 時，雖然LJJ 的細胞出現了不同程度萎縮、凹陷和變形，但其細胞上并未出現明顯的孔洞(圖6C)，表明SDS 在一定程度上通過抑制自溶酶活性而抑制菌體自溶的發生。

圖6 LJJ 正常細胞與自溶細胞的掃描電鏡圖片Fig．6 Electron micrographs showing the control cells and the autolysis cells of LJJ

3 討 論

3.1 乳酸菌的最適自溶條件

本研究確定的LJJ 的最適自溶條件為最適溫度50℃(0 ～50℃)，最適環境pH 6．0 ～8．0。該結果與李艾黎［8］等人和孫潔［9］等人分別研究的保加利亞乳桿菌KLDS 1．9201 和LD3 的最適自溶溫度55℃(0～55℃)，最適環境pH 5．5 ～7．5 和pH 6．0 ～7．0 基本一致。不同之處在于孫潔［9］等研究發現，當環境pH 7．5 時，自溶度就開始有所下降，而本研究發現雖然在最適pH 范圍內的初始階段自溶度隨會隨著pH的升高而增大，但自溶24h 時，不同環境pH 下的自溶度趨于相同。此外，Kang［10］，馮鎮［11］等研究的干酪乳桿菌和乳桿菌LB-3 的最適自溶條件也處于相一致的溫度及pH 范圍。

對數生長期菌體細胞自溶度最大的結論與Kang［10］等人的研究結論一致，但Kang［10］等人的研究發現來自對數生長初中末期的菌體細胞的自溶度間也存在顯著性的差異與本研究存在不一致處。比較兩者研究結果發現，當菌體生長至OD600nm約為1．5時，此時菌體細胞表現出最大的自溶活性。

3.2 乳酸菌自溶與自溶酶

據報道細菌自溶是由細菌中存在的若干自溶酶引起，即自溶酶破壞細胞壁對細菌自溶發揮著關鍵性作用［12-14］。

(1)最適自溶條件與乳酸菌自溶酶

LJJ 自溶的最適pH 和溫度范圍與自溶酶的最適作用條件一致。以研究較深入的溶菌酶［15-16］為例，其最適pH 范圍約在6．0 ～8．0，而最適作用溫度在65～75℃。當溫度高于65℃以上時，其熱穩定性開始降低，半衰期隨著溫度的升高快速減少。65℃時，溶菌酶半衰期大于3 h，75℃時半衰期則為45 min［17］。對比上述實驗結果，乳酸菌的自溶最適pH 范圍在6．0 ～8．0，與溶菌酶酶活的最適范圍pH 一致。自溶的最適溫度在60℃以下，低于溶菌酶的最適作用溫度，推測這是由于當溶菌酶在較高溫度下短期內的酶活雖有較大增強，但熱穩定性開始降低。在孵育的24 h 內，短時間的高酶活性的自溶效果要低于較低酶活性下長時間的自溶效果。

(2)不同生長階段自溶酶的變化規律

正常情況下，自溶酶對菌體細胞分裂作用是有序進行的，不會導致菌體的自溶，而一旦在外界刺激下將導致作用失序而引起自溶［18］。此時自溶酶產量越多，自溶速率也越高。對數生長期細菌快速增殖，細胞生命活動活躍，負責分裂子母代細胞細胞壁的自溶酶得以大量產生，所以處于此階段的細胞在分離、洗滌、懸浮后最易發生自溶。細菌生長進入穩定期后，由于細菌菌體處于相對穩定的動態平衡中，細胞的活躍度顯著降低，自溶酶生成量減少，難以發生自溶。當細菌生長進入衰退期后，由于營養、環境等因素的制約，部分菌體開始裂解死亡，且負責破壞細胞壁的自溶酶的產量比穩定期細胞有所增加［19］。

(3)乳酸菌自溶與自溶酶抑制劑和催化劑

SDS 對溶菌酶活性和對LJJ 自溶的抑制趨勢基本一致，Triton X-100 對溶菌酶活性和對LJJ 自溶的增強效果基本一致，均表明溶菌酶在LJJ 的自溶中起著重要作用。

已有的報道顯示，不同乳酸菌中自溶酶的種類及數量都各不相同［14，18］。因此，實現對LJJ 自溶的完全抑制，則需要對多種自溶酶同時存在抑制效果。而SDS 剛好是自溶酶中溶菌酶［20］、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶和部分內肽酶的強抑制劑［20］。因此，SDS對乳酸菌自溶的抑制效果，是與其較廣較強的自溶酶抑制范圍相一致的，是SDS 對自溶酶酶活抑制作用的結果。Triton X-100 被廣泛應用溶菌酶［21］，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶［22］于自溶酶酶譜分析的復性劑，其可以通過與變性蛋白的結合形成復合體，從而避免蛋白間聚合并在合適的條件下使蛋白正確折疊保持活性，從而在一定程度上起到催化自溶酶活性的效果［23］。

環境pH、溫度、SDS、Triton X-100 和不同生長階段等通過影響乳酸菌自溶酶活性而影響乳酸菌自溶。所以，通過調控乳酸菌自溶酶活性即可達到調控乳酸菌自溶的目的。

［1］ Angelis M D，Pollacci P，Gobbetti M． Autolysis ofLactobacillus sanfranciscensis［J］． European Food Research and Technology，1999，210 (1):57 -61．

［2］ ?stlie H M，Vegarud G，Langsrud T． Autolysis of propionibacteria:Detection of autolytic enzymes by renaturing SDS-PAGE and additional buffer studies［J］． International Journal of Food Microbiology，2007，117 (2):167 -174．

［3］ Slattery L，Callaghan J，Fitzgerald G F，et al．Lactobacillus helveticus-A thermophilic dairy starter related to gut bacteria［J］． Journal of Dairy Science，2010，93 (10):4 435 -4 454．

［4］ Chopin A，Bolotin A，Sorokin A，et al． Analysis of six prophages inLactococcus lactisIL1403:different genetic structure of temperate and virulent phage populations［J］．Nucleic Acids Research，2001，29 (3):644 -651．

［5］ Christensson C，Pillidge CJ，Ward LW，et al． Nucleotide sequence and characterization of the cell envelope proteinase plasmid inLactococcus lactissubsp．cremorisHP［J］．Journal of Applied Microbiology，2001，91 (2):334 -343．

［6］ Hickey DK，Kilcawley KN，Beresford TP，et al． Starter strain related effects on the biochemical and sensory properties of Cheddar cheese［J］． Journal of Dairy Research，2007，74 (1):9 -17．

［7］ Pillidge CJ，Rallabhandi PS，Tong XZ，et al． Autolysis ofLactococcus lactis［J］． International Dairy Journal，2002，12 (2 -3):133 -140．

［8］ 李艾黎，鄧凱波，霍貴成． 環境因素對酸奶菌株自溶的影響［J］． 微生物學通報，2008，35 (8):1262 -1267．

［9］ 孫潔． 乳酸菌發酵劑菌株的自溶特性及機理研究［D］． 北京:中國農業科學院，2010:29 -37．

［10］ Kang OJ，Vézinz LP，Labcrge S，et al． Some factors influencing the autolysis ofLactobacillus bulgaricusandLactobacillus casei［J］． Journal of Dairy Science，1998，81(3):639 -646．

［11］ 馮鎮，張蘭威． 乳酸菌發生自溶的影響因素研究［J］．中國乳品工業，2003，31 (3):7 -9．

［12］ Lortal S，Chartier MP． Role，mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese ［J］． International Dairy Journal，2005，15 (6 -9):857 -871．

［13］ Nobuya Inagaki，Akinori Iguchi，Takahiro Yokoyama，et al． Molecular properties of the glucosaminidase AcmA fromLactococcus lactisMG1363:Mutational and biochemical analyses［J］． Gene，2009，447 (2):61 -71．

［14］ Rice KC，Bayles KW． Molecular control of bacterial death and lysis［J］． Microbiology and Molecular Biology Reviews，2008，72 (1):85 -109．

［15］ 劉慧，王鳳山，楚杰． 蛋清溶菌酶部分酶學性質及酶活性的影響因素研究［J］． 中國生化藥物雜志，2008，29 (6):385 -387．

［16］ 李潛． 溶菌酶高產菌株的篩選及其產酶研究［D］． 石家莊:河北農業大學，2008:19 -29．

［17］ Goyal MK，Roy I，Banerjee UC，ea tl． Role of benzyl alcohol in the prevention of heat-induced aggregation and inactivation of hen egg white lysozyme ［J］． European Journal of Pharmaceutics ＆ Biopharmaceutics，2009，71(2):367 -376．

［18］ Vollmer W，Joris B，Charlier P，et al． Bacterial peptidoglycan (murein)hydrolases［J］． FEMS Microbiology reviews，2008，32 (2):259 -286．

［19］ Uehara T，Parzych KR，Dinh T，et al． Daughter cell separation is controlled by cytokinetic ring-activated cell wall hydrolysis［J］． EMBO Journal，2010，29 (8):1412 -1422．

［20］ Callewaert L，Herreweghe JM，Vanderkelen L，et al．Guards of the great wall:bacterial lysozyme inhibitors［J］． Trends in Microbiology，2012，20 (10):501 -510．

［21］ Jebava I，Plockova M，Lortal S，et al． The nine peptidoglycan hydrolases genes inLactobacillus helveticusare ubiquitous and early transcribed［J］． International Journal of Food Microbiology，2011，148 (1):1 -7．

［22］ Layec S，Decaris B，Leblond-Bourget N． Diversity of Firmicutes peptidoglycan hydrolases and specificities of the involved in daughter cell separation［J］． Research in Microbiology，2008，159 (7 - 8):507 -515．

［23］ Kerff F，Petrella S，Mercier F，et al． Specific structural features of the N -acetylmur -amoyl -L-alanine amidase AmiD fromEscherichia coliand mechanistic implications for enzymes of this family［J］． Journal of Molecular Biology，2010，397 (1):249 -259．