血管內皮細胞凋亡在兔腦血管痙攣模型的初步研究

涂建飛，劉一之，紀建松

自從Zubkov等于2000年首先報道1例因腦血管痙攣死亡患者的基底動脈內膜存在內皮細胞凋亡的事實后，人們開始關注血管內皮細胞（VEC）凋亡在痙攣中的臨床作用。而早期腦損傷概念［1-3］的提出，更是引發了VEC凋亡的研究熱潮。研究發現，早期腦損傷可能通過細胞凋亡、炎癥反應、缺血機制，最終導致細胞死亡，進而導致血腦屏障破壞、胞水腫，以至于神經元壞死。而早期腦損傷是死亡的重要原因，也是遲發性功能障礙的重要因素。因此，干預VEC凋亡成為治療腦血管痙攣的新靶點。然而，對于VEC凋亡的發生時間、意義則缺乏相關的研究，本文擬通過電鏡及免疫組化觀察VEC凋亡在腦血管痙攣中不同時間點的表達，為臨床治療提供理論依據并開拓新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

35只4～5月齡健康清潔級新西蘭大白兔由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供，體重2.5～3.5 kg，隨機分為 12 h、1、2、3、7 d 組，每組 7 只。 每組又分為蛛網膜下腔出血（SAH）亞組5只及對照亞組2只 （即導絲僅進入但未刺破頸內動脈）。出現死亡則給予補充。

1.2 動物模型的制備

采用血管內穿刺法制作兔SAH模型。用30%烏來糖（2.0～3.0 ml/kg）溶液靜脈注射麻醉成功后，采用外科方法通過兔股動脈引入0.035英寸超滑導絲和4 F H1導管，將導管插到右側頸總動脈中上段，常規行右頸總動脈造影，了解頸內動脈起始段血管走行。隨后引入塑形的EXCEL-14微導管（Boston 公司）和 Transend 微導絲（Cordis公司），在路圖狀態下將導管插到頸內動脈。然后引入微導絲硬頭到頸內動脈，快速將導絲推出導管約1 cm，重復1～2次后，退出導絲。最后撤離導管，右股動脈結扎，皮膚縫合。

1.3 透射電鏡及免疫組化觀察

1.3.1 透射電鏡觀察 12只實驗兔 （SAH亞組10只，對照組2只）分離出右頸內動脈，將血管迅速放入預冷的2.5%戊二醛溶液固定。常規丙酮梯度脫水，618環氧樹脂包埋，行超薄切片后透射電鏡觀察、攝片。

1.3.2 免疫組化觀察 三磷酸脫氧尿嘧啶缺口末端標記法 （TUNEL）操作按檢測試劑盒 （美國Biovision公司）說明書進行。在顯微鏡下觀察拍照。凋亡細胞的判定：細胞核固縮、致密、黃色或棕色改變；未凋亡細胞核呈藍色改變。每張玻片在顯微鏡高倍視野下觀察基底動脈 （BA）及后交通動脈（PCoA）的內皮細胞，計數TUNEL陽性細胞及正常內皮細胞，用百分數表示，統計凋亡率。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 動物行為學觀察

各SAH亞組動物術后第1天表現為嗜睡，活動差，厭食，以術后12～18 h最重。其中1只實驗兔昏睡2 d。大多數動物1 d后精神狀態逐漸好轉。7 d時同正常組無明顯不同。

2.2 血管痙攣的形態學結果

在各觀察時間點內，所有SAH亞組動物PCoA及BA均出現管腔內直徑縮小，12 h組最明顯，隨后在第7天再次明顯收縮。而血管壁厚度的增加，則以7 d組最明顯（表1）。

2.3 電鏡表現

SAH亞組血管內皮間緊密連接消失，部分內皮細胞核固縮，空泡化，彈力膜扭曲。平滑肌細胞胞質內線粒體腫脹，空泡化，粗面內質網擴張，部份細胞出現核邊集，核固縮（圖1）。PCoA內皮細胞凋亡動態變化見圖2。

表1 動物腦血管動態改變（ ± s）

表1 動物腦血管動態改變（ ± s）

注：PCoA=后交通動脈，BA=基底動脈

參數 對照組 12 h組 1 d組 2 d組 3 d組 7 d組PCoA直徑 196.81±10.16 110.88±13.30 159.88±11.61 151.89±16.10 139.98±20.67 139.09±8.56 PCoA管壁 28.45±6.71 32.96±4.24 32.45±7.01 35.18±7.97 34.94±3.71 44.65±8.33 BA直徑 428.72±24.37 206.58±23.32 333.06±23.02 293.40±10.96 338.97±19.37 234.97±16.56 BA管壁 43.39±3.89 51.36±12.35 52.82±7.13 52.04±7.21 50.95±8.31 62.62±5.70

2.4 內皮細胞凋亡表現

PCoA 內皮細胞凋亡率（%）在對照組、12 h、1、2、3、7 d組 凋 亡率 分 別 為 0.01 ± 0.02、0.06 ±0.06、0.26 ± 0.20、0.31 ± 0.12、0.39 ± 0.16、0.29 ±0.07。對照組內皮細胞核呈藍色，未見TUNEL陽性細胞。SAH亞組中，12 h組和7 d組偶見TUNEL陽性細胞 （圖3、4），1 d組內皮細胞出現TUNEL陽性細胞，在3 d組達到高峰。7 d組較前有所下降。對照組與1、2、3、7 d組比較差異有統計學意義 （P<0.02）；2 d組和3 d組分別與12 h組和1 d組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。本組平滑肌細胞可見TUNEL陽性細胞，與電鏡表現相符。由于多張切片未找到BA血管斷面，未對BA行統計學分析。

圖1 SAH后2 d，內皮細胞核邊集，凋亡樣改變

圖2 內皮細胞凋亡時間曲線圖

3 討論

細胞凋亡是調節機體生長、發育及維持機體細胞平衡的重要生理機制。然而，當其調節紊亂，則會導致疾病的發生。近期研究表明，腦血管疾病特別是缺血性腦血管疾病（包括狹窄與痙攣）的病理損傷程度與細胞凋亡密切相關。SAH后痙攣血管壁內皮細胞存在凋亡現象，在腦血管痙攣形成機制中起重要作用［4-6］。本研究擬重點觀察細胞凋亡的時間窗及意義，為今后深入研究凋亡的價值作一鋪墊。

本實驗發現SAH后12 h VEC凋亡不明顯，在第1天少量出現，在2～3 d明顯增加，3 d組達到峰值，7 d組明顯下降。兩種觀察法均支持此點。對于凋亡的出現時間與葉偉等［7］和 Cahill等［8］的研究基本相符，實驗均證實VEC凋亡出現的時間可能在SAH后24 h，細胞凋亡進一步造成血腦屏障的完整性受到影響，導致腦水腫及細胞壞死，可能是加重早期腦損害的主要原因。

圖3 SAH后12 h BA內皮細胞無凋亡，部分內皮細胞脫落（HE，× 40）

圖4 SAH后2 d PCoA內皮細胞凋亡(HE，×100)

對于細胞凋亡的持續時間，Cahill等［8］采用大鼠穿刺模型研究24、72 h的血管凋亡情況，雖然血管痙攣持續72 h，但是發現凋亡在24 h明顯升高，72 h下降。史煥昌等［9］采用兔注血模型在SAH后72 h檢查發現VEC凋亡。游鴻海等［10］在二次注血的兔模型上發現，細胞凋亡和Cyt-C表達均在SAH后增多，于第7天達高峰，第10天逐漸下降。Zubkov等對二次注血的狗模型行血管造影發現，SAH后3 d開始出現血管痙攣，7 d達高峰。通過形態學檢查發現，3 d在痙攣血管內皮出現凋亡樣細胞，凋亡程度隨時間加重。這種凋亡時間上的改變，目前認為氧合血紅蛋白是細胞凋亡的主要誘因。血塊中分解出代謝產物（如氧合血紅蛋白）需要一定的時間，而氧合血紅蛋白一般在2 d內從外膜穿過血管壁并停留在內皮，故本實驗VEC凋亡高峰出現時間遲，在2～3 d達到高峰。至于細胞凋亡高峰時間不同的原因可能是：①動物種類的差別。選用不同種屬的動物，可能出現不同的觀察結果。②制作方法不同。注血法是由于腦池內血塊分解出代謝產物，凋亡誘因再作用于血管內皮需要一段時間，因而可能表現為凋亡時間延遲。而我們采用血管內穿刺法，細胞因子和血管剪切力等因素均在早期作用于內皮，可能使細胞凋亡峰值提早。我們認為二次注血模型雖然在痙攣時間上模擬了人的痙攣時間，但二次注血的凋亡誘因多次作用于內皮，可能不能準確模擬VEC凋亡的時間窗。

通過本組實驗，我們認為早期的少量細胞凋亡可能是細胞因子等因素直接作用于內皮所致，而后期的大量凋亡則是氧合血紅蛋白作用的結果。在后期，氧合血紅蛋白濃度下降，導致VEC凋亡減少，這可部分解釋本實驗中7 d組VEC凋亡減少的原因。

本實驗亦發現血管壁的平滑肌細胞和成纖維細均出現凋亡改變。細胞凋亡以SAH后1、2 d明顯，凋亡峰值時間早于腦血管痙攣，表明凋亡誘因作用于血管壁全程，本實驗中，3、7 d組出現膠原增多，平滑肌細胞和成纖維細胞增生可能與此有關。Park等的實驗結果表明，SAH后腦血管痙攣過程中確實有細胞凋亡的發生，細胞凋亡的程度以受累VEC為最重，其次是某些下丘腦神經元細胞，大腦皮層受累最輕，表明細胞凋亡在腦血管痙攣的后期亦是重要因素，主要是在遲發性痙攣的早期階段發揮作用，主要通過刺激細胞增生、損傷神經元細胞等方式參與。

細胞凋亡的途徑主要有兩條［11］，一條是通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶caspase，另一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些caspase的活化可將細胞內的重要蛋白降解，引起細胞凋亡。有文獻報道，通過細胞凋亡的通路抑制細胞凋亡，雖然不能預防腦血管痙攣，但能改善臨床癥狀，減輕早期腦損害，上述研究為治療和預防腦血管痙攣闡釋增加了新的思路［12-15］。

本實驗中，BA多支血管斷面未找到內皮細胞，主要是VEC在受到刺激后容易脫落，其次是TUNEL法的固有缺限，在以后的研究中，可考慮輔以Western印跡技術檢測ADP核糖多聚合酶（PARP）判斷VEC凋亡，從而提高判斷凋亡的準確性。

綜上所述，本研究在兔腦血管穿刺模型上證實VEC出現凋亡現象，凋亡主要出現在SAH后24 h，本組在3 d達峰，略早于遲發性痙攣的峰期，表明VEC凋亡在腦血管痙攣中起重要作用。

［1］Cheng G，Wei L，Zhi-dan S，et al.Atorvastatin ameliorates cerebral vasospasm and early brain injury after subarachnoid hemorrhage and inhibits caspase-dependent apoptosis pathway［J］.BMC Neurosci，2009，10： 7.

［2］Cahill J，Zhang JH.Subarachnoid hemorrhage： is it time for a new direction？ ［J］.Stroke，2009，40： S86-S87.

［3］Cahill J，Calvert JW，Zhang JH.Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26： 1341-1353.

［4］李 冉，秦 川，高俊玲，等．VEGF/ERK通路在蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣中的作用及機制探討 ［J］．現代預防醫學，2010，37： 2292-2293，2297．

［5］Yan JH，Yang XM，Chen CH，et al.Pifithrin-alpha reduces cerebral vasospasm by attenuating apoptosis of endothelial cells in a subarachnoid haemorrhage model of rat ［J］.Chin Med J（Engl），2008，121： 414-419.

［6］He Z，Ostrowski RP，Sun X，et al.Targeting C/EBP homologous protein with siRNA attenuates cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage ［J］.Exp Neurol，2012，238：218-224.

［7］葉 偉，王曉峰，趙春波，等．蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣與c-myc，c-fos，c-jun表達的關系 ［J］．中華實驗外科雜志，2006，23： 1118-1120．

［8］Cahill J，Calvert JW，Solaroglu I，et al.Vasospasm and p53-Induced apoptosis in an experimental model of subarachnoid hemorrhage［J］.Stroke，2006，37： 1868-1874.

［9］史煥昌，毛伯鏞，施賢清．蛛網膜下腔出血后血腦屏障通透性的實驗研究［J］．中風與神經疾病雜志，2006，23：475-477．

［10］游鴻海，王燈亮，康德智，等．細胞色素C在兔蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣中的作用 ［J］．中國微侵襲神經外科雜志，2011，16： 231-234．

［11］葉 偉，王曉峰，趙春波，等．蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的發生機制研究進展［J］．中華實驗外科雜志，2006，23：124-126．

［12］余建明，莫云長，梁冬冬，等．尼莫地平對兔癥狀性腦血管痙攣的保護效應［J］．中華醫學雜志，2011，91： 345-349．

［13］ Endo H，Nito C，Kamada H，et al.Akt/GSK3beta survival signaling is involved in acute brain injury after subarachnoid hemorrhage in rats［J］.Stroke，2006，37： 2140-2146.

［14］ Suzuki H，Sozen T，Hasegawa Y，et al.Caspase-1 inhibitor prevents neurogenic pulmonary edema after subarachnoid hemorrhage in mice［J］.Stroke，2009，40： 3872-3875.

［15］ Sugawara T，Jadhav V，Ayer R，et al.Thrombin inhibition by argatroban ameliorates early brain injury and improves neurological outcomes after experimental subarachnoid hemorrhage in rats［J］.Stroke，2009，40： 1530-1532.