針刺對大鼠顱腦損傷后Nogo-A表達的實驗研究

田貴華，王錫友，姚海江，李志剛

（1.北京中醫藥大學東直門醫院推拿科,北京 100029；2.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029）

現代醫學研究發現，影響顱腦損傷（CCI）后中樞神經修復的因素主要包括神經營養因子（NTF）缺乏、軸突生長抑制因子和軸突導向因子等[1-4]。軸突生長抑制因子是目前顱腦損傷研究的熱點之一[5]。

Nogo-A作為軸突生長抑制因子Nogo的異構體之一，其對軸突再生的抑制作用最強。本實驗采用針刺顱腦損傷大鼠督脈上的“百會”、“人中”兩穴進行干預治療，運用免疫組化方法對各組大鼠腦組織軸突再生抑制因子nogo-A的蛋白表達含量進行檢測，分析針刺對顱腦損傷大鼠損傷腦組織軸突再生抑制因子nogo-A蛋白表達的影響，從而對針刺治療顱腦損傷的機制進行研究分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠（由中國醫學科學院實驗動物中心提供），180只，體質量250~280 g。適應環境3 d后進入實驗，適應期間采用12 h明/暗周期（早 7∶00~晚 7∶00）照明，自由飲水進食。根采用隨機數字表法將大鼠隨機分為3組，即電針組、模型對照組、正常對照組，每組60只，然后再將每組隨機分成 6h、1d、6d、12d，4 個時間組，每個時間組12只。

1.1.2 針具 用華佗牌無菌針灸針，規格為0.30mm×13 mm。電針采用用韓氏（HANS）電針儀，型號為LH-402H，由北京大學醫學部神經科學研究所監制。

1.2 方法

1.2.1 顱腦損傷模型制備 參照Feeney等研制的鼠顱腦創傷模具進行改進設計打擊裝置,對模型組和針刺組大鼠造成左頂葉局限性腦挫裂傷。術前大鼠禁食8 h，經40%氟烷誘導麻醉后稱體質量，然后腹腔注射濃度為10 g/L的戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，麻醉成功后俯臥位固定。用8%Na2S清除手術部位鼠毛并消毒皮膚，正中切開，剝離骨膜，暴露左頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5 mm，中線旁2.5 mm處鉆一直徑5 mm骨窗，保持硬膜完整。將撞桿置于硬膜上，用20 g砝碼置于30 cm高處沿外周導管墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，造成中度顱腦損傷。按神經功能損傷程度評分（NSS）簡易準則評估，分值為4~6者屬中度損傷，提示造模成功。打擊后切口內滴注4萬單位硫酸慶大霉素4~5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。正常對照組不予處理[6]。

1.2.2 行為學觀察 各組手術后，分別于6h、1d、6d、12 d進行行為學觀察。參照NSS制定簡易評估準則得分越高，說明顱腦損傷越重。神經損傷傷情共包括10項，提尾時后腿屈曲、不能在地上直線行走、翻正反射（righting reflex）消失、肢體位置反射（placing reflex）消失、驚嚇反射消失、無尋覓行為、俯臥、不能完全伸直其前肢、木條平衡作業少于60秒（1cm寬）、不能在4 cm寬木條上行走，每項各1分，共10分。

1.2.3 治療方法 于造模后即刻以1寸（同身寸，下同）毫針針刺“人中”、“百會”兩穴，將針柄分別連接至電針儀的電極上，“百會”穴接陰極，“人中”穴接陽極，持續脈沖電流，頻率2 Hz，強度2 mA，時間為30 min。正常組和模型組在治療時間均要抓取1次，以保證和針刺組大鼠的條件相同。電針組中的各時間點組于每天同一時間點治療1次。

1.2.4 標本制備 各時間點組（6h、1d、6d、12d）大鼠分別于手術后6 h、1 d、6 d、12 d斷頭處死，在冰片上迅速取出損傷部位腦組織，然后用-4℃的生理鹽水沖洗干凈后置凍存管，迅速投入液氮保存待測。

1.2.5 免疫組化 石蠟切片經常規脫蠟處理后，3%H2O2避光浸泡30 min，枸椽酸緩沖液行抗原修復。3%正常兔血清37℃孵育30 min，羊抗人在37℃孵育2 h或孵育30 min后放入4℃冰箱過夜；生物素標記的兔抗羊IgG 37℃孵育30 min；辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液。37℃孵育30 min后DAB顯色試劑盒顯色。蘇木精復染。常規脫水，透明，封片[6]。

1.3 圖像處理和統計學分析 采用ipp6.1圖像分析系統，各組每只大鼠取5張切片，隨機視野中陽性反應細胞測其灰度值，每張片隨機取5個視野，取其均值作為每一例的平均灰度。統計分析采用SPSS 18.0軟件。計量資料以均值±標準差（±s）表示。3組之間整體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 Nogo-A蛋白表達圖像分析結果 見表1。

表1 顱腦組織中Nogo-A蛋白表達圖像分析結果（±s）Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue（±s）

表1 顱腦組織中Nogo-A蛋白表達圖像分析結果（±s）Tab.1 The image analysis results of the protein expression of Nogo-A in craniocerebral tissue（±s）

注：與模型組比較*P<0.05,**P<0.01，與空白組比較#P<0.05，##P<0.01。

組別 n 6 h n 24 h n 48 h 6 d模型組 10 213.973±57.640 10 258.583±42.047 9 541.796±186.832 530.758±159.812空白組 11 164.366±17.005** 11 164.366±17.005* 11 164.366±17.005** 164.366±17.005**電針組 09 640.991±144.238**## 11 368.708±53.727**## 10 333.170±90.058**## 213.428±54.840**

2.2 免疫組化結果 見圖1。

3 討論

中醫學認為顱腦損傷的病機為氣機逆亂氣滯、經絡阻滯，主要病理因素為水停、瘀血、痰濕，各因素互為因果從而造成患者神志、語言及運動等方面的障礙。治療原則為活血化瘀、化痰開竅、疏通經絡?！鞍贂?、“人中”為督脈之要穴，“百會”為足太陽經、手足少陽經、足厥陰經與督脈之會，能升清化瘀，有助于瘀血的消散和吸收，更可補神益智，疏通腦絡?！叭酥小笔鞘?、足陽明經與督脈之會，為危急病癥的常用針刺急救穴位，可明顯地促進腦血循環，增加腦灌注量，改善微循環障礙。督脈電針，不但可以調節督脈經氣、疏通氣血，還是一種脈沖電場，具有針刺和電場雙重作用。臨床實踐及實驗證明[1-2]電針能促進CCI后神經功能的恢復。

中樞神經系統（CNS）損傷后產生的大量軸突生長抑制因子，是阻礙CNS再生的重要原因。它具有3種主要異構體，分別是Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C，其中以Nogo-A與神經再生的關系最為密切，是作用最強烈的神經再生抑制物質[7]。Nogo-A在大鼠生長發育階段表達明顯，在神經發展成熟后，其在腦內呈低水平表達，當神經組織損傷重建時，Nogo-A的表達可再次增強[8-10]。研究表明,腦組織內Nogo-A的表達量在顱腦損傷后的早期即發生改變，這一變化伴隨急性顱腦損傷的整個過程，并且與顱腦損傷的輕重程度以及損傷后神經功能恢復的好壞密切相關。Nogo-A作為中樞神經軸突生長抑制因子最為重要的一個,也是反映急性顱腦損傷后腦組織病理改變的敏感指標。本實驗觀察到，在正常成年大鼠（空白組）顱腦細胞中，Nogo-A蛋白表達較低，顱腦損傷后的6 h、24 h、48 h和6d Nogo-A蛋白表達顯著升高，炎性細胞開始在損傷周圍浸潤。此時損傷位點上方前角運動神經元中Nogo-A蛋白表達明顯增加，而針刺組6 h顯著升高，從24 h開始，Nogo-A表達逐漸開始下降，48 h、6 d時，Nogo-A蛋白的表達都顯著低于模型組。這提示，電針治療對大鼠脊髓損傷后Nogo-A蛋白表達具有明顯的抑制作用。電針促進顱腦損傷大鼠神經修復的機制可能涉及很多方面，依據本實驗結果，可以證實下調Nogo-A蛋白表達，促進神經再生可能是其重要機制之一。

[1]李志剛,劉書坤.近十年電針治療脊髓損傷的臨床和實驗研究概況[J].中國中醫藥科技2004,11(6):386-388.

[2]韓清民,謝杰,柴生顫,等.電針督脈對實驗性脊髓損傷大鼠水通道蛋白-4的影響[J].中國中西醫結合雜志,2005,7(25):637-639.

[3]Wang K H,Brose K,Arnott D,et al.Biochemical purification of amammalian slit protein as a positive regulator of sensory axonelongation and branching[J].Cell,1999:771-784.

[4]孫 青,田國慶.糖尿病腦病發病機制及藥物干預概況[J].中華中醫藥雜志,2009,24(4):502-505.

[5]Juri R,Matthias M.What does it mean to identify a protein in proteomics Trends in Biochemical Sciences[J].2002,27(2):74.

[6]田貴華,譚純,姚海江,等.針刺對大鼠顱腦損傷后軸突導向因子Slit2表達的影響[J].中華中醫藥雜志,2011,26（5）:1197-1200.

[7]NiederostB,OertleT,FritscheJ,etal.Nogo-Aandmyelin-associated glycoprotein mediate growth inhibition by antagonistic regulation of RhoA and Racl[J].JNeurosci,2002,22(23):10368-10376.

[8]Mingorance-Le Meur A,Zheng B,Soriano E,et al.Involvement of the myelin-associated inhibitor Nogo-A in early cortical developmentandneuronalmaturation[J].CerebCortex,2007,17:2375-2386.

[9]Tsai SY,Markus TM,Andrews EM,et al.Intrathecal treatment with anti-Nogo-A antibody improves functional recovery in adult rats after stroke[J].Exp Brain Res,2007,182:261-266.

[10]Schwab ME,Mir A,Rouiller E,et al.Intrathecally infused antibodies against Nogo-A penetrate the CNS and downregulate the endogenous neurite growth inhibitor Nogo-A[J].Mol Cell Neurosci,2006,32:161-173.

圖1 3組不同時間免疫組化結果Fig.1 The results of immunohistoche mistry at different time among 3 groups