透骨草提取物對人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及凋亡相關因子的影響*

李 萍，曾常茜

（1.吉林省圖們市人民醫院內科，圖們 133100；2：大連大學醫學院，大連 116622）

透骨草（Phryma leptostachyaL.var.asiatica Hara）為透骨草科植物的干燥全草入藥，具有清熱解表、活血消腫作用[1]。文獻報道，透骨草提取物對多種腫瘤細胞增殖有顯著抑制作用[2]。本實驗首次將透骨草提取物作用于人肝癌SMMC-7721細胞，觀察透骨草提取物對SMMC-7721細胞凋亡及凋亡相關蛋白caspase-9、-3、-7和X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）蛋白表達的影響，探討透骨草提取物誘導SMMC-7721細胞凋亡的分子機制，旨在為透骨草抗肝癌作用的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 人肝癌SMMC-7721細胞由吉林省腫瘤研究所提供；鼠抗人caspase-9、-3、-7抗體購自Cell Signaling Technology公司，鼠抗人XIAP單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術公司。RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶為美國Gibco公司產品；藥物采自遼寧金州大黑山，經王心毓老先生鑒定為透骨草科植物（Phryma leptostachyaL.var.asiatica Hara）；流式細胞儀（FACSNANTATE-SETM）為美國BD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 透骨草提取物制備方法 采取加熱回流提取法，取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2 h，過濾，濾液水浴濃縮成干膏。

1.2.2 細胞培養 SMMC-7721細胞培養于10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，在37℃，5%二氧化碳（CO2）的條件下培養。胰酶消化傳代，每2~3 d傳代1次,實驗選用對數生長期細胞。

1.2.3 實驗分組 SMMC-7721細胞生長至對數生長期，實驗組加入透骨草提取物溶液，終濃度為40.91 μg/mL，對照組加入 RPMI-1640培養液，繼續培養24 h。

1.2.4 流式細胞術檢測SMMC-7721細胞凋亡 分別收集經實驗組和對照組的SMMC-7721細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，用預冷70%乙醇4℃固定24 h，PBS洗滌2次，制成1 mL細胞懸液，加入20 U/mL Rnase，37℃水浴1 h，再加入含碘化丙啶（100 μg/mL）染色，4 ℃避光染色 30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 免疫組化法檢測SMMC-7721細胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達 按試劑盒說明進行操作。分別收集實驗組和對照組的SMMC-7721細胞，制成細胞懸液涂片，丙酮固定。3%過氧化氫室溫孵育15 min。正常山羊血清室溫孵育15 min。分別與鼠抗人Caspase-9、-3、-7抗體、鼠抗人XIAP抗體37℃孵育2 h，PBS洗3次。與生物素標記二抗室溫孵育 15 min，PBS洗3次。與ABC液室溫孵育10 min，PBS洗3次。DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、脫水、封片，顯微鏡下觀察，細胞核或細胞漿出現棕色或棕褐色顆粒判斷為陽性細胞，無棕色染色者為陰性細胞，計數200個細胞并計算陽性細胞占所有細胞的比例。

1.2.6 統計學處理 實驗數據采用SPSS18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較行單因方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 透骨草提取物對SMMC-7721細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細胞凋亡率為（3.76±1.01）%，而用 40.91 μg/mL透骨草提取物作用 24 h的SMMC-7721細胞凋亡率為（26.84±1.23）%，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。

表1 流式細胞術檢測SMMC-7721細胞凋亡結果（±s，n＝3）Tab.1 Apoptosis rates of SMMC-7721 cells with flowcytometry（±s，n＝3）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 凋亡率對照組 3.76±1.0140.91 μg/mL 透骨草提取物處理組 26.84±1.23*

2.2 透骨草提取物對SMMC-7721細胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達的影響 免疫組化方法觀察結果顯示，未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細胞Caspase-9蛋白高表達，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量多，經40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細胞Caspase-9蛋白表達明顯降低，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量少，經統計學處理差異顯著（P＜0.05）；未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細胞Caspase-3蛋白高表達，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量多，經40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細胞Caspase-3蛋白表達明顯降低，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量少，經統計學處理差異顯著（P＜0.05）；未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細胞Caspase-7蛋白高表達，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量多，經40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細胞Caspase-7蛋白表達明顯降低，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量少，經統計學處理差異有統計學意義（P＜0.05）；未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細胞XIAP蛋白低表達，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量少，經40.91μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細胞XIAP蛋白表達明顯增加，細胞漿或細胞核著棕黃色的細胞量多，經統計學處理差異有統計學意義（P＜0.05），見表 2。

表2 SMMC-7721細胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達結果（±s，n＝3）Tab.2 The expression of protein of Caspase-9、-3、-7 and XIAP in SMMC-7721 cells（±s，n＝3）

表2 SMMC-7721細胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達結果（±s，n＝3）Tab.2 The expression of protein of Caspase-9、-3、-7 and XIAP in SMMC-7721 cells（±s，n＝3）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 Caspae-9 Caspase-3 Caspae-7 XIAP對照組 51.2±1.9 59.8±2.2 42.6±1.5 11.4±1.040.91 μg/mL 透骨草提取物處理組 14.7±1.2*17.3±1.1*11.2±0.8*43.7±2.3

3 討論

現代研究表明，中醫藥在防治腫瘤過程中扮演著不可替代的角色[3-4]。中藥物抗腫瘤的活性與藥物引起腫瘤細胞發生凋亡密切相關[5-7]。本實驗將透骨草提取物作用于SMMC-7721細胞，結果表明SMMC-7721細胞凋亡率顯著高于對照組，說明透骨草提取物可誘導SMMC-7721細胞凋亡。

Caspases是以天冬氨酸為底物的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡調控過程中具有重要作用[8-9]。當細胞在損傷因素作用或接受凋亡信號時，促使細胞色素C從線粒體中釋放出來并與凋亡酶激活因子-1結合，形成多聚體，并促使Caspase-9前體與其結合形成凋亡小體，導致Caspase-9被激活，激活的Caspase-9再激活Caspase-3、-7，導致細胞凋亡[10]。本研究結果表明40.91 μg/mL透骨草提取物處理SMMC-7721細胞 24 h后，Caspase-9、-3、-7蛋白表達水平與對照組相比顯著下降，說明透骨草提取物可能通過激活Caspase級聯反應誘導SMMC-7721細胞凋亡。

XIAP是最有效的內源性Caspases抑制因子，其在多種腫瘤細胞中過表達[11]。XIAP抑制細胞凋亡的機制主要是XIAP的BIR2結構域與Caspase-3、Caspase-7結合，而XIAP的BIR3結構域與Caspase-9結合，從而抑制細胞凋亡[12]。本研究結果表明40.91 μg/mL透骨草提取物處理SMMC-7721細胞24 h，XIAP蛋白表達水平與對照組相比顯著增高，說明透骨草提取物通過抑制XIAP，進而通過Caspase級聯反應誘導SMMC-7721細胞凋亡。

總之，透骨草提取物能通過XIAP/Caspase信號通路誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡，透骨草提取物是否通過其他的凋亡相關蛋白誘導SMMC-7721細胞凋亡,有待進一步深入研究。

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