一種檢測帕金森患者血漿促進α-突觸核蛋白寡聚體形成能力的方法

李 昕 楊巍巍 李 雁 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京100053;2.北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實驗室，北京100053)

黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元死亡是導(dǎo)致帕金森病(Parkinson’s disease，PD)運動障礙的主要原因。然而，以路易體(Lewy body，LB)為特征的PD病理變化不僅存在于黑質(zhì)，也廣泛見于神經(jīng)系統(tǒng)的其他部位［1－2］。已知，LB的主要成分是聚集的 α－突觸核蛋白(α－synuclein，α－Syn)［3－6］。證據(jù)［7－8］表明，聚集成寡聚體的 α－Syn對神經(jīng)元具有毒性作用。雖然直接檢測PD患者腦脊液和血漿中的α－Syn寡聚體水平被誤認為有助于診斷PD患者的病理變化［9－10］，然而檢測PD患者體內(nèi)促成α－Syn聚集的內(nèi)在環(huán)境變化將從不同角度了解患者的發(fā)病機制。LB病理的廣泛存在提示機體內(nèi)環(huán)境的改變可能是促使α－Syn易于形成寡聚體的原因。因此檢測血液促進α－Syn寡聚體形成的能力對了解PD患者的病理狀況具有重要意義。

以下介紹一種檢測PD患者血漿促進α－Syn寡聚體形成的方法，這種方法可以區(qū)別PD患者和正常對照血漿在影響α－Syn寡聚體形成上的差別。

1 材料和方法

1.1 血漿樣本的收集和處理

PD患者血漿采自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診的原發(fā)性PD患者，并排除其他原因引起的帕金森綜合征。患者年齡為50至70歲，H－Y分期為2至4級，并簽訂知情同意書。抽取患者空腹靜脈血5 mL，置于含有抗凝劑的塑料管中，4℃、3 000 r/min離心20 min，取上層血漿分裝于Eppendorf管中－80℃保存?zhèn)溆谩φ战M血漿來自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院體檢中心參加體檢的受試者，年齡為50至70歲，并簽訂知情同意書。血漿樣本的采集和存儲與PD患者相同。

1.2 重組蛋白的表達和純化

將含有α-Syn基因的pET重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至適當(dāng)密度(A600=0.4～0.6)，加入異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β－D－1－thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達3 h，超聲破碎獲得 α－Syn蛋白，進一步用Duoflow中高壓液相層析系統(tǒng)(DuoFlow 10/40，Bio－Rad 公司，美國)，依次經(jīng)過離子交換柱(TSK－gel SuperQ－5PW，TOSOH 公司，日本)、疏水層析柱(TSK－gel Phenyl－5PW ，TOSOH 公司，日本)及反相層析柱(TSK－gel Phenyl－5PW RP，TOSOH 公司，日本)純化。純化后的α－Syn蛋白經(jīng)BCA法定量和Western blotting鑒定后，冷凍抽干－80℃分裝保存。

1.3 α-突觸核蛋白寡聚體標(biāo)準(zhǔn)的制備

將α－Syn以不同質(zhì)量濃度溶于0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，37℃、280 r/min 振蕩孵育 24、48、72、96 h。

1.4 α-突觸核蛋白寡聚體的ELISA測試

參照文獻［10］所描述的方法檢測溶液中α－Syn寡聚體。簡言之，用濃度為1 μg/mL的3D5單抗［11］包被96孔酶標(biāo)板，用含2.5%明膠的PBST于37℃封閉2 h。加入α－Syn寡聚體，37℃孵育2 h，加入生物素標(biāo)記3D5抗體(終質(zhì)量濃度1 μg/mL)，37℃孵育2 h。向各孔加入100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素(3∶5 000)，37℃孵育2 h。以上每一步驟之后用PBST沖洗各孔4次。最后加入100 μL對硝基酚磷酸顯色液(pNpp)，室溫顯色30 min。405 nm處測定吸光度值。

1.5 Western blotting 分析

將新鮮配制α－Syn及孵育后的α－Syn分別用15%SDS－PAGE分離后，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。PVDF膜與單克隆抗體3D5(1∶10 000)室溫孵育2 h，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL法檢測辣根過氧化酶活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，各處理組與對照組數(shù)據(jù)比較用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-Syn寡聚體標(biāo)準(zhǔn)的Western blotting鑒定

將100 μmol/L 重組人 α－Syn 在 0.01 mol/L PBS(pH 7.3)中于37℃振蕩孵育不同時間，所獲樣本進行Western blotting分析，結(jié)果如圖1所示。在未經(jīng)振蕩孵育的α－Syn溶液中只有單體存在，而在振蕩孵育的樣本中，不僅存在單體，而且可見不同程度聚合的寡聚體，包括二聚體、三聚體、四聚體、六聚體等。隨振蕩時間的延長，α－Syn的聚合程度逐漸增加，而α－Syn單體則逐漸減少并最后消失。本課題組選用振蕩120 h的樣本作為α－Syn寡聚體標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 振蕩孵育時間對α-Syn寡聚體形成的影響Fig.1 Effect of incubation time on α-Syn oligomerization

2.2 α-Syn寡聚體的酶聯(lián)免疫吸附測定檢測

用所建立的ELISA方法分別對α－Syn單體和寡聚體進行測試，結(jié)果如圖2所示。該ELISA法特異性識別α－Syn寡聚體，不識別α－Syn單體。405 nm吸收值與α－Syn寡聚體質(zhì)量濃度呈明顯的線性關(guān)系，r2為0.9906。

圖2 α-Syn單體和寡聚體質(zhì)量濃度對405 nm吸收值關(guān)系曲線Fig.2 Correlation curves between the concentrations of α-Syn monmers and oligomers versus the absorbance at 405 nm

2.3 血漿稀釋倍數(shù)對α-Syn寡聚體形成的影響

用PBS稀釋PD和對照血漿，將100 μmol/L重組人α－Syn溶解于不同稀釋倍數(shù)的血漿，37℃振蕩孵育120 h，ELISA測試α－Syn在PD血漿和對照血漿中的寡聚體形成情況。結(jié)果(圖3)顯示，α－Syn在血漿原液以及稀釋倍數(shù)低于3倍的情況下可以形成較多的聚合體，而且聚合程度在PD和對照血漿之間有顯著差異。進一步稀釋血漿導(dǎo)致α－Syn的聚合程度明顯降低，并且在PD和對照血漿之間的差異消失。

2.4 蛋白質(zhì)量濃度、振蕩時間對α-Syn寡聚體形成的影響

將不同質(zhì)量濃度α－Syn在PBS稀釋3倍的PD和對照血漿振蕩孵育不同時間比較，尋找能夠?qū)е娄粒璖yn在PD和對照血漿中形成寡聚體差異最大的蛋白質(zhì)量濃度和孵育時間，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，在蛋白質(zhì)量濃度為100 μmol/L，孵育時間為48 h條件下，α－Syn在PD和對照血漿中形成的寡聚體含量的差異最大。增大蛋白質(zhì)量濃度和延長孵育時間雖然能夠增加寡聚體的形成，但寡聚體在PD和對照血漿中的差異減少。

圖3 血漿稀釋倍數(shù)對α-Syn寡聚體形成的影響Fig.3 Effect of plasma dilution on α-Syn oligomerization

圖4 蛋白質(zhì)量濃度和振蕩孵育時間對α-Syn寡聚體形成的影響Fig.4 Effect of protein concentration and incubation time on α-Syn oligomerization

2.5 α-Syn在PD患者和對照血漿中寡聚體形成的比較

根據(jù)以上研究，將100 μmol/L重組α－Syn在3倍稀釋的PD和對照血漿中孵育48 h，測試了32例PD患者血漿和32例對照受試者血漿。統(tǒng)計結(jié)果顯示，α－Syn在PD患者血漿中形成的寡聚體含量明顯高于對照血漿(圖5)。

圖5 α-Syn寡聚體形成在PD患者和對照受試者的差異Fig.5 Differentiation of α-Syn oligomerization in the plasma of PD patients and control subjects

3 討論

本課題組建立了一種能夠檢測PD患者血漿促進α－Syn寡聚體形成能力的方法，該方法包括制備 α－Syn寡聚體標(biāo)準(zhǔn)，特異性識別α－Syn寡聚體的ELISA方法，以及有助于區(qū)別α－Syn在PD和對照血漿寡聚體形成差異的最佳血漿稀釋倍數(shù)、α－Syn質(zhì)量濃度和孵育時間。α－Syn是易于聚集的蛋白質(zhì)。α－Syn不僅在PD患者體內(nèi)可以形成寡聚體，而且在體外振蕩孵育條件下也可以形成寡聚體［12］。無論體內(nèi)病理情況下還是體外振蕩孵育條件下形成的α－Syn寡聚體均對去污劑具有抵抗作用。根據(jù)這一特性，采用變性條件下的SDS－PAGE和Western blotting方法對體外振蕩孵育的α－Syn樣本進行鑒定。結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)量濃度為100 μmol/L、振蕩頻率為280 r/min、振蕩孵育溫度為37℃、振蕩孵育時間為120 h條件下，樣本中的α－Syn單體完全消失，并形成從二聚體至六聚體不等的不同程度聚合的α－Syn寡聚體。因此，將這一條件下形成的α－Syn寡聚體樣本作為ELISA測試的α－Syn寡聚體標(biāo)準(zhǔn)蛋白。然后，根據(jù)文獻［9］所描述的原理，利用本室自制的小鼠抗人α－Syn單克隆抗體建立了針對α－Syn寡聚體的ELISA檢測方法。所建立的ELISA方法可以特異性識別α－Syn寡聚體，而對α－Syn單體不產(chǎn)生反應(yīng)。為了尋找α－Syn在PD患者血漿形成寡聚體的最佳條件，并且在這一條件下形成的寡聚體可以最大程度地在含量上區(qū)分對照血漿形成的寡聚體，對血漿稀釋度、振蕩孵育時間以及α－Syn質(zhì)量濃度進行了分析。結(jié)果表明，PD患者血漿在不低于原液1/3稀釋的情況下對α－Syn在的聚合無明顯影響，并且可以顯著區(qū)分α－Syn在PD患者和對照血漿的聚合程度。而進一步增加血漿稀釋倍數(shù)則使α－Syn的聚合量減少，并與對照血漿的差異消失。其原因可能與過度稀釋導(dǎo)致血漿中影響α－Syn聚合的病理因素減弱有關(guān)。此外，100 μmol/L的蛋白質(zhì)量濃度和48 h孵育可以最大程度地區(qū)分PD患者和對照血漿中α－Syn的聚合程度。進一步增加α－Syn質(zhì)量濃度和延長孵育時間雖然可以增加α－Syn的聚合程度，但α－Syn在PD患者和對照血漿中的聚合程度的差異逐漸縮小。這可能與α－Syn在PD患者血漿中的聚合達到飽和有關(guān)。

本文所描述方法有助于判定PD患者機體內(nèi)環(huán)境的變化，這種變化可以促進α－Syn的聚合，后者是引起PD患者神經(jīng)元退變的重要原因。因此，利用本文所建立的方法檢測PD患者血漿促進α－Syn的聚合能力可以在一定程度上了解PD患者的病理變化。

［1］George S，Rey N L，Reichenbach N，et al.α－Synuclein:the long distance runner［J］.Brain Pathol，2013，23(3):350－357.

［2］Jellinger K A.Critical evaluation of the Braak staging scheme for Parkinson’s disease［J］.Ann Neurol，2010，67(4):550.

［3］Spillantini M G，Schmidt M L，Lee V M，et al.Alpha－synuclein in Lewy bodies［J］. Nature， 1997，388(6645):839－840.

［4］Baba M，Nakajo S，Tu P H，et al.Aggregation of alphasynuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies［J］.Am J Pathol，1998，152(4):879－884.

［5］Ferrer I，Martinez A，Blanco R，et al.Neuropathology of sporadic Parkinson disease before the appearance of parkinsonism:preclinicalParkinson disease［J］. JNeural Transm，2011，118(5):821－839.

［6］Sulzer D，Surmeier D J.Neuronal vulnerability，pathogenesis，and Parkinson’s disease［J］.Mov Disord，2013，28(1):41－50.

［7］Kalia L V，Kalia S K，McLean P J，et al. α－Synuclein oligomers and clinical implications for Parkinson disease［J］.Ann Neurol，2013，73(2):155－169.

［8］Danzer K M，McLean P J.Drug targets from genetics:alpha－synuclein［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，201，10(6):712－723.

［9］Park M J，Cheon S M，Bae H R，et al.Elevated levels of α－synuclein oligomer in the cerebrospinal fluid of drug－na?ve patients with Parkinson’s disease［J］.J Clin Neurol，2011，7(4):215－222.

［10］El－Agnaf O M，Salem S A，Paleologou K E，et al.Detection of oligomeric forms of alpha－synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson’s disease［J］.FASEB J，2006，20(3):419－425.

［11］Yu S，Li X，Liu G，et al.Extensive nuclear localization of alpha－synuclein in normal rat brain neurons revealed by a novel monoclonal antibody［J］.Neuroscience，2007，145(2):539－555.

［12］程芙蓉，李昕，殷娟娟，等.過氧化氫和帕金森病患者血清促進α－突觸核蛋白向線粒體與細胞核轉(zhuǎn)運［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，31(6):732－736.