苜蓿素對人直腸癌SW1116細胞增殖和凋亡的作用及其機制

陳 艷，姚 宏，林新華

1福建醫科大學藥學院藥物化學系;2福建醫科大學藥學院藥物分析系，福州 350004

苜蓿素(Tricin，4'，5，7-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮)是天然黃酮的一種，廣泛存在于中草藥中，也存在小麥、大麥、米等谷類食物中［1］。有報道，苜蓿素可抑制結腸癌SW480細胞、HT29細胞菌落的形成［2］;也可抑制人 MDA-MB-468乳腺癌細胞，阻滯細胞周期于G2/M，但未誘導凋亡［3］;通過抑制COX酶和PGE2，從而降低了ApcMin鼠腺瘤的發生［4］。苜蓿素對人結腸癌細胞的作用機制尚未見報道，本研究觀察苜蓿素對人結腸癌SW1116細胞增殖和凋亡的作用，并探討其作用機制。

1 材料

電泳儀(美國EC公司)、熒光顯微鏡IX70(O-lympus)、流式細胞儀(BD FACSCalibur)、Gel DOC 2000凝膠成像系統(美國伯樂公司)、DYCP-31C型電泳槽(北京六一儀器廠)和Microplate Reader 450酶標儀(美國Bio-Rad公司)。人直腸癌SW1116細胞株購自中國科學院上海細胞所，細胞培養于含10%小牛血清的1640培養液中，在37℃，飽和濕度及5%CO2培養箱中連續進行細胞傳代培養，實驗時取對數生長期細胞;苜蓿素為本實驗室從蒲葵子中提取分離得到(經HPLC測定，面積歸一化法檢測，苜蓿素的質量分數為 99.0%)［13］。RPMI-1640(Gibico公司)，小牛血清、DMSO、MTT均購自Amresco公司，DNA Mark、DNA Ladder抽提試劑盒(離心柱式)購自碧云天試劑有限公司，細胞凋亡試劑盒為南京凱基，BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀，ECL增強型化學發光底物檢測試劑盒為北京中杉。吖啶橙(AO，Fluka公司)，溴化乙錠(EB，華美公司)，碘化丙啶(PI，Sigma公司);其余試劑均為分析純產品。

2 方法

2.1 MTT法檢測苜蓿素對SW1116細胞生長抑制實驗

取對數生長期的SW1116細胞接種于96孔培養板中，每孔接種180 μL，細胞接種密度為2×104/mL，在37°C，5%CO2的培養箱中培養24 h。之后，藥物組加入等體積不同濃度的藥物20 μL/孔，使其終濃度分別為 100，20，4，0.8，0.16 μg/mL;每組濃度設3個復孔。在5%CO2培養箱中培養72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續孵育4 h 后，棄凈上清液，每孔加入150 μL DMSO，37 °C 振蕩10 min，使其充分溶解。酶聯檢測儀492 nm波長處測定吸光度(A)值。計算細胞生長抑制率，抑制率(IR%)=［(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)］×100%;以不同濃度的苜蓿素為橫座標，以抑制率為縱坐標，繪制苜蓿素對SW1116細胞增殖抑制的影響曲線，并計算半數抑制濃度IC50值。

2.2 熒光顯微鏡觀察苜蓿素對SW1116細胞生長形態的影響

取對數生長期SW1116細胞，全培養液稀釋成4×104/mL接種于96孔培養板，加入不同濃度的苜蓿素，使終濃度分別為20，4 μg/mL;設立對照組(加入等體積溶劑的培養液)，孵育72 h，加入10 μL丫啶橙AO和溴化乙錠EB混合液，立即置熒光顯微鏡觀察并拍照(激發波長490 nm)。

2.3 流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期分布

收集 60，20，2 μg/mL 苜蓿素作用 72 h 的SW1116細胞，PBS洗滌細胞，加入70%冷乙醇固定過夜，離心去除乙醇，PBS洗滌細胞，加入RNase(0.5 mg/管)，輕輕懸浮細胞，37 °C 孵育30 min。4 °C避光PI染色30 min，用300目濾網過濾，應用流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析DNA Ladder測定

取對數生長期的SW1116細胞，以含10%小牛血清的RPMI 1640培養液稀釋并接種于6孔板上，使成5×104個/孔，37°C 、5%CO2條件下孵育24 h后，加藥，使苜蓿素的終濃度為 100，20，4 μg/mL，同時設空白對照組，繼續培養72 h。收集細胞，按照DNA Ladder試劑盒說明書方法進行 DNA提取。DNA上樣5 μL，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，2 V/cm，電泳分析，將凝膠浸入EB中染色30 min，采用凝膠成像分析儀觀察并照像［5］。

2.5 Western Blotting檢測蛋白表達

根據待測蛋白要求制膠，上樣(100 μg/孔)，電泳，電轉膜儀轉膜，取下膜用Fast Green Solution預染，洗10 min，標記Marker，裁剪膜，5%(w/v)脫脂奶粉室溫封閉30 min，TBST洗10 min，加一抗4°C孵育過夜，TBST洗5×3 min，加二抗室溫輕搖40 min，TBST洗5×3 min，發光試劑盒顯色1 min，放入暗盒，固定，拍片，標記分析存檔。所有結果采用β-Tubulin為內參，用Densitometry(Molecular Dynamics)灰度掃描軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 苜蓿素對SW1116細胞生長的抑制作用

人結腸癌細胞SW1116對苜蓿素敏感，藥物作用72h后，隨著苜蓿素藥物濃度的升高，細胞抑制率升高，呈劑量依賴性(見圖1)，其中得出IC50值的苜蓿素作用濃度為8.11 μg/mL。

圖1 不同濃度苜蓿素作用72 h對細胞抑制率的影響Fig.1 Inhibition rate of SW1116 cells after treated by tricin with different concentration for 72 h

3.2 苜蓿素對SW1116細胞生長形態的影響

通過熒光顯微鏡觀察，AO/EB染色后，對照組細胞全部被染成綠色，細胞壁完整(見圖2A)。苜蓿素(4 μg/mL)組SW1116細胞，出現大量的核染色質呈固縮狀或圓珠狀(見圖2B);苜蓿素(20 μg/mL)作用72 h后，可見明顯的粒狀熒光體聚集，即凋亡小體，同時可見大量細胞裂解、壞死，發出紅色熒光(見圖2C)。

圖2 不同濃度的苜蓿素對SW1116細胞生長形態的影響(AO/EB染色，×400)Fig.2 Morphological alterations of SW1116 cells which were treated by tricin with different concentrations(AO/EB staining，×400)

3.3 苜蓿素對SW1116細胞凋亡的影響

流式細胞儀對細胞周期分布的檢測結果表明，苜蓿素作用72 h后，細胞出現G0/G1期堆積，G2/M細胞的比例明顯降低;細胞凋亡比例開始上升，由中濃度時的7.87%，上升為高濃度時的16.04%，揭示苜蓿素可以阻滯SW1116細胞周期，誘導細胞凋亡(見表1;圖3)。

圖3 苜蓿素對SW1116細胞生長周期的影響圖Fig.3 Effect of tricin on cell cycle distribution

3.4 瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA結構變化

SW1116細胞經不同濃度的苜蓿素作用72 h后，經瓊脂糖凝膠電泳譜顯示，出現“階梯狀”DNA Ladder帶，大小分別約為100～200 bp，細胞發生凋亡。陰性對照組細胞未見DNA Ladder，4 μg/mL苜蓿素作用72 h，開始出現DNA Ladder，且隨著給藥濃度的加大，DNA Ladder條帶越明顯，表明苜蓿素能引起細胞內DNA發生斷裂，從而導致細胞凋亡。

圖4 DNA斷裂電泳分析Fig.4 DNA fragmentation electrophoresis

3.5 苜蓿素對SW1116細胞相關蛋白的影響

用苜蓿素 60，20，2 μg/mL 作用 SW1116 細胞72 h后，Western blot檢測凋亡調控蛋白Bcl-2和Bax的水平。隨苜蓿素劑量增大，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平逐漸變淡，苜蓿素60 μg/mL下調作用最明顯，而促凋亡蛋白Bax條帶灰度則逐漸增粗，呈量效關系(見圖5)。

圖5 苜蓿素對SW1116細胞蛋白表達的影響Fig.5 The influence of protein expression on SW1116 cells by tricin

4 討論

癌癥嚴重威脅著人類的健康和生命安全，目前發病率和死亡率均呈逐年上升趨勢。因此，研究高效、低毒的抗癌藥物具有重要意義，而從中草藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤成分已經成為現代抗腫瘤藥物發展的熱點之一［6］，如紫杉醇、喜樹堿、雷公藤內堿、三尖杉酯堿等。蒲葵子為棕櫚科蒲葵屬植物蒲葵Livistona chinensis(Jacq.)R.Br．的種子，民間廣泛用其治療各種癌癥，現代藥理學研究也證實其抗癌療效顯著［7-12］。由于迄今蒲葵子抗腫瘤的藥效基礎尚不明確，特別是有效成分及其機制缺乏系統研究。本實驗室對蒲葵子進行系統的分離，其中分離得到的苜蓿素是一種天然的黃酮成分，且其在蒲葵子中的含量較高［13］，因此對其活性進行研究。

本實驗采用不同濃度的苜蓿素處理SW1116細胞，AO/EB熒光染色分析，出現凋亡的典型特征，并可見凋亡小體。通過DNA電泳譜顯示，SW1116細胞經不同濃度的苜蓿素作用72 h后，出現“階梯狀”DNA Ladder帶，且給藥濃度越大，DNA Ladder條帶越明顯，提示苜蓿素導致SW1116細胞核酸內切酶激活DNA降解，誘導細胞凋亡。另外，采用流式細胞儀分析了各時相的細胞周期分布情況，結果顯示苜蓿素可以阻滯細胞周期，使腫瘤細胞產生選擇性的G0/G1期堆積，影響細胞生長，從而抑制細胞增殖。

Bcl-2是一種原癌基因，其家族成員分兩類，如Bcl-X1、Mcl-1、Bcl-2 等抑制凋亡的蛋白和 Bax、Bad、Bak、Bid等促凋亡蛋白［14］。當 Bc1-2過表達時，與Bax形成異二聚體抑制細胞凋亡;相反，Bax過表達時，Bax形成同源二聚體促進細胞凋亡。Bcl-2和Bax對細胞凋亡的調控不僅取決于自身表達水平高低，還與兩者的比例有關。當Bcl-2/Bax比例減少時，導致游離型Bax蛋白相對增多。而游離型Bax可以使線粒體外膜發生滲漏化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)，引發經線粒體途徑介導的細胞死亡［15］。本實驗通過蛋白免疫印跡法檢測了Bcl-2和Bax蛋白水平，用苜蓿素處理SW1116細胞72 h后，Bcl-2蛋白表達低于對照組，而Bax表達增強。苜蓿素引起Bcl-2/Bax比例減少，是通過死亡受體途徑及線粒體途徑引起細胞凋亡，從而抑制細胞增殖。

由此可推知，苜蓿素為蒲葵子可能的有效成分之一，提取分離工藝穩定，重現性好，可以大量制備。另外也說明苜蓿素可能通過阻滯細胞周期及誘導細胞凋亡共同作用來發揮抗腫瘤作用，為蒲葵子活性評價提供可靠的依據。

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