桑黃抗氧化活性化合物的分離純化及結構解析

王欽博，楊 焱，馮 娜，艾連中，穆海菠，杭 鋒，宋 馨

1乳業生物技術國家重點實驗室光明乳業股份有限公司，上海200436;2農業部南方食用菌資源利用重點實驗室上海市農業科學院食用菌研究所國家食用菌工程技術研究中心，上海201403

桑黃(Phellinus sp.)俗稱桑臣、桑耳、桑黃菇等，主要生長于楊、松、桑、白樺等樹的樹干上，造成心材白腐，是一種珍貴的傳統藥用真菌，桑黃隸屬擔子菌亞門(Basidiomyeotina)，層菌綱(Hymenomycetes)、多孔菌目(polyporales)、銹革孔菌科(Hymenochaetacae)，針層孔菌屬(Phellinus)，又分為裂蹄層孔菌(Linteus)，鮑氏層孔菌(Baumii)，火木層孔菌(Igniarius)、瓦尼木層孔菌(Vaninii)，尤地層孔菌(Yucatanensis)等多個種。國內外文獻報道的桑黃藥理活性已引起國際醫藥工業界和保健品行業專家的關注，有著相當可觀的市場前景。目前對于桑黃藥理活性的研究多集中在抑制腫瘤細胞生長和調節免疫能力方面，此外，還有抗菌、抗氧化、降血糖、抗突變、抗纖維化、抗肺炎等作用。

目前對桑黃抗氧化的活性研究主要集中在不同萃取部分［1，2］，但少有針對較強抗氧化活性化合物的分離純化和結構解析的研究報道。本文利用實驗室前期得到的抗氧化效果較好的乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相，針對其中的抗氧化活性化合物進行分離純化，并對其結構解析。為研究桑黃抗氧化物質的作用原理、構效關系及其活性物質對人體的功效提供了理論基礎。

1 材料與試劑

桑黃PB-10(Phellinus baumii)子實體及菌種由上海市農科院食用菌研究所提供，標本存放于上海市農科院食用菌研究所藥用真菌研究室。

桑黃(Phellinus Baumii)子實體的乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相干燥后得到樣品;TLC薄層層析板(HSGF254)為煙臺匯友硅膠開發有限公司生產;柱層析硅膠(100～200目)為青島海洋化工廠生產。乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、30%雙氧水、氯化亞銅為國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑;氘代試劑為美國Cambridge Isotope Laboratorics Inc.產品。0.05%胰蛋白酶、RPMI1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清、DMSO(二甲基亞砜)購自GIBCO公司;脂多糖(LPS)、魯米諾、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、鄰苯三酚、鄰菲羅啉、兒茶素［(+)-catechin］購自 Simga公司;MTT(噻唑藍)購自Biosource公司。PC12來自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。

2 實驗方法

2.1 樣品的分離純化

取乙酸乙酯萃取部分進行硅膠(100～200目)層析，氯仿-甲醇(100∶0 ～ 60∶40)梯度洗脫，共收集211個流分。根據薄層層析(TLC)檢測結果合并相近的流份，合并為24個組分，分別是:A1(1-9)、A2(10-28)、A3(29-33)、A4(34-37)、A5(38-47)、A6(48-53)、A7(54-57)、A8(58-71)、A9(72-73)、A10(74-75)、A11(76-87)、A12(88-110)、A13(111-117)、A14(118-124)、A15(125-136)、A16(137-142)、A17(143-148)、A18(149-155)、A19(156-162)、A20(163-169)、A21(170-176)、A22(177-183)、A23(184-187)、A24(188-211)。

將A5上Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫。收集20～36組分再經聚酰胺層析，甲醇-水(30∶70～90∶10)梯度洗脫，其中1～11組分有沉淀析出，用甲醇反復洗滌，得到化合物1。

A6有沉淀析出，甲醇反復洗滌，得到化合物2。

A11有沉淀析出，甲醇反復洗滌，得到化合物3。

將 A12進行聚酰胺層析，甲醇-水(50∶50 ～0∶10)梯度洗脫。其中10～52組分有沉淀析出，用甲醇反復洗滌，得到化合物4。64～81組分也有沉淀析出，用丙酮反復洗滌，得到化合物5。

取正丁醇部分用氯仿-甲醇(7∶3)超聲溶解，將其中的沉淀濾出，甲醇洗滌3次，得到的沉淀物質命名為化合物6。

經鑒定化合物5同化合物3為同一化合物，且化合物1和化合物4取得量較少，本文以化合物2、化合物3及化合物6作為抗氧化研究對象。

2.2 清除超氧陰離子實驗

對于非酶體系的清除超氧陰離子實驗有多種方法可以檢測，在本章實驗中使用魯米諾-鄰苯三酚-CBS(碳酸鈉-碳酸氫鈉)體系的化學發光法。在郭藹光［3］等報道的化學發光方法基礎上作適當的修改。將樣品及陽性對照均用95%乙醇配制成不同濃度(5、10、20、50、100、200 μg/mL)，用 95%乙醇作為空白，以兒茶素做為陽性對照組，在20℃啟動發光反應，每0.6 s記錄一次發光值，連續記錄30 s。超氧陰離子的清除率計算公式如下:

2.3 清除羥基自由基實驗

方法參照HongFei Fu［4］的化學發光的方法，并稍作改動。先于96孔板中加入10 μL 1 mmol/L CuCl和10 μL 1 mmol/L 鄰菲羅啉。后加入 10 μL用95%乙醇配制的不同濃度的樣品及陽性對照(0.05、0.1、0.5、1 、5、10 μg/mL)，用 95% 乙醇做為空白對照，以兒茶素做為陽性對照組。在20℃啟動發光反應，每0.6 s記錄一次發光值，連續記錄30 s。羥基清除率公式同超氧陰離子清除率計算公式。

2.4 清除DPPH·自由基實驗

根據 Brand-Williams［5］等所述方法，并稍做改動。用70%乙醇將樣品及陽性對照配制成不同濃度(5、10、20、50、80 μg/mL)。以 70% 乙醇作為空白，以兒茶素做為陽性對照組。對DPPH·自由基清除率計算如下:

2.5 抑制NO·自由基產生實驗

實驗方法參照文獻［6］，并作適當改動。取生長對數期179 μL細胞濃度為5×105的RAW264.7細胞加入96孔板，并加入1 μL不同濃度(2 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL)樣品，1 h后在96孔板中加入20 μL 10 μg/mL LPS，于37 ℃，5%的 CO2培養24 h后，吸取100 μL 上清，并加入 50 μL Griess試劑，混勻后放至25℃ 10 min，并于540 nm下測吸光值，以10 μg/mL LPS 組為陰性對照組。按照文獻［7］的方法計算細胞產生NO·含量。

2.6 對PC12神經細胞損傷修復實驗

參照胡金霞［8］實驗方法，并略作改動。將分離純化的單體分別用 DMSO溶解并稀釋成2、10、20 mg/mL的溶液，取對數生長期的 PC12細胞，用DMEM培養基稀釋至2×104個/mL。取190 μL細胞懸液接于96孔板中，然后分別加入10 μL 2.5 mmol H2O2刺激4 h。將全部培養基吸出后加入199 μL新鮮培養基和1 μL不同濃度樣品，每個樣品重復3孔，于5%CO2，37℃細胞培養箱中培養48 h后，使用MTT方法測定PC12存活率(損傷組表示加入雙氧水刺激后不加任何樣品，只加入新鮮的培養基)。

2.7 化合物的結構鑒定

對分離純化獲得的抗氧化較強的化合物進行核磁共振和質譜分析。1H NMR譜和13C NMR譜用Varian Inova 500型核磁共振儀(美國Varian公司)，以四甲基硅烷(TMS)為內標測定。API-ES用HP.5973N質譜儀(美國HP公司)(以甲醇為溶劑)，直接進樣測定。

2.8 數據分析

文中各項數據均用標準偏差(SD)表示，并使用SPSS 13.0分析軟件統計，將實驗樣品組與對照組進行比較。

3 結果與分析

3.1 分離化合物清除超氧陰離子實驗結果

經過純化后的化合物3在清除超氧陰離子能力方面有了明顯的提高，在高濃度時，乙酸乙酯相和化合物3對超氧陰離子的清除率較為接近，與陽性對照組相比，化合物3在100 μg/mL濃度以上時，對超氧陰離子清除率較高?；衔?也有一定的清除能力，但增加趨勢較弱(圖1)。實驗結果表明，化合物2無清除超氧陰離子能力。

圖1 分離化合物清除超氧陰離子實驗結果Fig.1 The superoxide scavenging ability of separated compounds and ethyl acetate extracts

3.2 清除羥基自由基實驗結果

由圖2看出，化合物3清除羥基自由基的作用與原乙酸乙酯相接近，略有提高。與陽性對照組相比，化合物3羥基清除率較低?；衔?也表現了一定的清除羥基自由基作用，但清除效果較乙酸乙酯萃取相低，而化合物2未表現出清除羥基自由基能力。

圖2 分離化合物清除羥基實驗Fig.2 The hydroxyl radical-scavenging activity of separated compounds and ethyl acetate extracts

3.3 清除DPPH·自由基實驗結果

清除DPPH·自由基實驗結果表明，在20 μg/mL時，化合物3比乙酸乙酯相更有效地清除了DPPH·自由基(圖3)，與陽性對照組相比，化合物3在50 μg/mL濃度以上時，DPPH·清除率較高?；衔?清除DPPH·的能力相對較弱，化合物2基本無清除能力。當樣品濃度高于50 μg/mL時，各樣品對DPPH·的清除能力基本達到最高值。

圖3 分離化合物清除DPPH·自由基實驗Fig.3 The DPPH·scavenging activity of separated compounds and ethyl acetate extracts

3.4 抑制NO·產生實驗結果

由于NO脂溶性較強，能夠通過細胞膜，因此可以在細胞間起廣泛的作用。當NO的含量過高時，NO會與其他自由基發生反應，產生損傷能力更強的亞硝基自由基。NO在體內有三種存在形式—NO·、NO+、NO-，三者能與體內多種化合物起反應，使自由基的鏈式反應不斷增長。因此，有效清除體內過量的NO·自由基也能起到抗氧化作用。

本實驗利用巨噬細胞RAW264.7產生NO·自由基作為實驗模型，研究了幾種分離化合物及乙酸乙酯相對NO·自由基的清除作用(圖4)，結果表明，乙酸乙酯相和化合物3能很有效地抑制巨噬細胞產生NO·自由基，在高濃度組中，在兩者作用下的巨噬細胞產生的NO·自由基量與空白組產生量接近。而化合物6和化合物2在抑制NO·自由基產生上無效果。

圖5 分離化合物修復PC12實驗Fig.5 Recovery of damaged PC12 nerve cells with separated compounds and ethyl extracts

3.5 分離純化樣品對神經細胞PC12的損傷修復

從圖5中可以看出，乙酸乙酯相及分離的化合物3對損傷PC12細胞均有修復作用，低濃度下，化合物3對損傷PC12的修復作用相對乙酸乙酯相有了一定的提高?；衔?在中高濃度下有一定修復神經細胞的作用。化合物2的修復作用濃度依賴關系不夠明顯。

3.6 化合物3的結構分析

抗氧化實驗表明化合物3具有很好的清除自由基及細胞水平的抗氧化作用，采用核磁共振及質譜分析方法對化合物3進行了結構鑒定，其特征為:黃色無定形粉末，分子式為C25H18O9。

從化合物的正離子API-ES m/z:463.0［M+H］+和NMR譜可推斷其分子式為C25H18O9。從1H NMR上質子的化學位移可以判斷化合物有一個甲基質子信號δ 1.93(3H，s)、反式雙鍵上的兩個質子信號［δ 6.79(1H，d，J=15 Hz)，δ 7.32(1H，d，J=14 Hz)］和六個芳香質子信號［7.08(1H，s)，7.01(1H，d，J=8.0 Hz)，6.78(1H，d，J=8.5 Hz)，6.73(1H，d，J=8 Hz)，6.67(1H，d，J=1.5 Hz)，6.53(1H，t，J=1，8 Hz)］。從耦合常數判斷該化合物有兩個具有鄰位和對位取代的苯環結構和一個反式烯鍵結構。從13C NMR上的甲基碳信號(δ 16.2)、反式雙鍵的碳信號(115.8、137.5)和芳香碳信號(δ 114.4、145.7、148.2、115.9、121.2、121.1、114.6、144.9、146.3、115.2、118.7)進一步印證了該化合物具有一個甲基、一個反式雙鍵和兩個芳香環的結構的推測。此外，從13C NMR上還發現了羰基碳信號(δ 157.3、199.6)。由 H-H COSY、HMQC 和HMBC譜，找到化合物3的各個質子和碳的連接，結合文獻報道［10］，得出該化合物是一種吡喃酮類的化合物(圖7)，首次從lnonotus xeranticus的甲醇萃取物中得到該化合物，并命名為Inoscavin A。

4 討論

自由基的產生和消失在正常的機體狀態下總是保持著平衡，當自由基過多就會對機體產生一定的氧化損傷，從而導致細胞衰老、機體產生病變，因而抗氧化活性是天然物質開發重要的評價指標之一。有關環境傷害導致衰老和老年退行性疾病的最新研究多集中在自由基氧化和非酶糖基化的衰老領域中?？寡趸钚晕镔|一方面能夠清除自由基的損傷;另一方面，抗氧化活性物質可能通過提高機體內超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，抑制脂質過氧化，降低體內丙二醛的生成，從而起到保護和修復機體組織細胞的作用，因而達到延緩衰老的目的［9］。由此可見，修復損傷細胞能力從細胞水平上反映了抗氧化物質的活性。由此可見，修復損傷細胞的能力在細胞水平上為評價抗氧化作用提供了必要的參考。另有研究發現，對于同一種抗氧化活性物質，在不同的抗氧化模型中會出現不一致的作用效果［10］，有此，在抗氧化作用的研究中，往往引用多種抗氧化模型進行綜合評價。

本文以篩選出的抗氧化能力較強的桑黃(Phellinus baumii)子實體乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相干燥樣品為研究對象，對其進行分離純化，將純化后得到的化合物分別進行清除超氧陰離子、羥基、DPPH·及NO·自由基和修復損傷神經細胞的抗氧化實驗。實驗結果表明了分離得到的化合物3具有較強的清除自由基能力，較乙酸乙酯萃取相的清除能力有所提高;化合物3對損傷的PC12神經細胞也表現出很好的修復能力。對化合物3進行1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HMQC 等波譜分析并結合相關文獻報道［2］數據，鑒定出其化學式為C25H18O9，是一種吡喃酮類的化合物。Jong-Pyung Kim 等［2］首次從 lnonotus xeranticus的甲醇萃取物中得到該化合物，并命名為Inoscavin A，另外，莫順燕［9］從桑黃(Phellinus igniarius)乙酸乙酯萃取相也分離得到同樣的化合物。兩位學者對該化合物只進行了清除DPPH·自由基的抗氧化實驗。本文首次從桑黃(Phellinus baumii)中分離出Inoscavin A，并著重從清除自由基及細胞水平方面引用多種抗氧化模型綜合評價該化合物的抗氧化能力，對該化合物的抗氧化作用做了更深入地研究。

本次實驗針對桑黃子實體(Phellinus baumii)抗氧化能力強的化合物進行了分離純化和結構解析，該活性化合物的發現和鑒定為認識桑黃抗氧化物質的作用原理及其構效關系奠定了基礎。有關體內抗氧化實驗及其他臨床、毒理實驗尚未進行，在今后的實驗中還需對該活性化合物進行相關驗證，為天然抗氧化物質的開發應用提供更多的理論支持。

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