沒食子酸酯對神經細胞的抗氧化保護作用研究

田 偉，畢玉婷，周啟龍，薛艷紅，仇 敏，但飛君，劉士平

三峽大學化學與生命科學學院，宜昌 443002

神經細胞的氧化損傷會造成多種退行性疾病，如帕金森癥(PD)、阿爾茨海默病(AD)和亨廷頓氏病(HD)等［1］。保護神經元免受氧化脅迫，在氧化應激的代謝途徑中尋找合適的抗氧化劑，是防治這類疾病的有效手段之一［2，3］。沒食子酸(gallic acid，GA，3，4，5-三羥基苯甲酸)，是一種抗氧化活性較高的天然產物，可清除機體內的氧自由基，但由于其有強刺激性和細胞毒性，油溶性差，所以在臨床上常用其酯類作為抗氧化劑［4］。如沒食子酸丙酯(Propyl gallate，PG)能有效防護脂氧化作用對細胞的損傷，對細胞的毒副作用很小，是美國、歐盟和世界衛生組織批準使用的抗氧化劑［4］。本文從三峽流域特有瀕危植物疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)［5］中分離到一種3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯(沒食子酸甲酯的衍生物，以下簡稱二甲氧酯)，建立了過氧化氫對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y的氧化損傷模型，比較了它與沒食子酸乙酯、沒食子酸正丙酯、沒食子酸異戊酯，沒食子酸正辛酯對神經細胞氧化損傷的保護作用，探討了其細胞毒性的差異，以期為新型神經退行性疾病藥物的開發和設計提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗中使用的試劑有:D-MEM/F-12完全培養基(內含2.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素，10% 新生小牛血清)，D-MEM/F-12基礎培養基(內含3%新生小牛血清)，胰蛋白酶(美國GIBCO公司)，四氮唑藍(MTT，美國AMRESCO公司)，過氧化氫(H2O2，國藥集團西安公司)。試劑均為分析純。

人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心惠贈。沒食子酸酯系列化合物(沒食子酸乙酯、沒食子酸正丙酯、沒食子酸異戊酯、沒食子酸正辛酯)均通過有機合成方法獲得(樣品純度均達到99%以上)，來自于三峽大學化學與生命科學學院但飛君教授實驗室。

實驗所需儀器主要有酶聯免疫檢測儀(Genios Tecan)，核磁共振儀(UltrashiedTM，Bruker)，CO2培養箱(日本三洋公司)，LD4-2A離心機(北京醫用離心機廠)，XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)，96孔板(美國Corning公司)。

1.2 3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的分離與鑒定

取干燥的疏花水柏枝研磨成粉末，用95%乙醇回流提取，提取液減壓濃縮得總浸膏。總浸膏用適量4%HCl冷浸，酸水液用飽和Na2CO3依次調pH至7、10、12，分別用氯仿萃取，濃縮得不同pH條件下的提取物和沉淀。其中pH7條件下的提取物，經氯仿、甲醇梯度洗脫硅膠柱層析及Sephadex LH-20、制備薄層法(PTLC)、重結晶等技術手段分離1個單體化合物，經1H NMR、13C NMR鑒定為3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯，分子式為C10H12O。

1.3 沒食子酸酯系列藥物溶液的制備

分別取3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯、沒食子酸乙酯、沒食子酸正丙酯、沒食子酸異戊酯、沒食子酸正辛酯5 mg，置于EP管中，各加入50 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解后，再加入450 μL無水乙醇，配成終濃度為10 mg/mL的藥物溶液備用。

1.4 細胞培養

SH-SY5Y細胞用D-MEM/F-12完全培養基于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養。細胞每2 d換一次培養基，待細胞80% ～90%鋪滿瓶底時進行傳代、轉板。在傳代時，倒掉舊培養基后，先用PBS緩沖液將細胞清洗，再用0.25%的胰蛋白酶置于CO2培養箱中進行干消化約40 s，離心后按1∶3比例進行傳代［7］。

1.5 細胞毒性試驗

為評價藥物對細胞的毒害作用并確定最適給藥濃度，我們用MTT法評價了不同藥物的細胞毒性。將對數生長期的SH-SY5Y細胞稀釋后，接種于96孔板中，待神經細胞生長至80%匯合時，加入濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 的各種藥物，加藥量為100 μL/孔。培養24 h后棄去培養液，加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的培養基繼續培養4h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，輕輕振搖96孔板使甲瓚顆粒充分溶解，用全自動酶聯免疫檢測儀于492 nm波長處測定吸光度(OD)值，計算細胞存活率(存活率=處理組OD值/空白組OD值×100% ，下同)［8］。

1.6 H2O2氧化損傷模型的建立

神經細胞生長至80%匯合時，棄去舊培養液，加入不同濃度(400、600、800、1000 μmol/L)的 H2O2溶液(基礎培養基稀釋而成)，空白對照組只加入基礎培養基，繼續培養8 h后用MTT法測吸光值，計算細胞存活率。選取50%～60%細胞死亡的H2O2濃度進行后續實驗［9］。

1.7 沒食子酸酯系列藥物的篩選及量效關系分析

SH-SY5Y細胞生長至80%匯合時進行預給藥，分別加入濃度梯度為 25、12.5、6.25、3.125、1.0625 μg/mL的沒食子酸酯類化合物(基礎培養基配制而成)，每個濃度5個復孔。培養24 h后棄去培養液，模型組加入濃度為800 μmol/L的H2O2溶液，給藥組加入相應濃度的藥物及濃度為800 μmol/L的H2O2溶液，繼續培養8 h后用MTT法測吸光值，計算細胞存活率［10］。

1.8 統計學處理

2 結果與分析

2.1 3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的分離與鑒定

疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)是一種分布在三峽河岸帶地區的珍稀民間藥材，當地人常用來治療風濕、燙傷等疾病。本實驗用干燥的疏花水柏枝粉末，經回流提取、減壓濃縮后，在pH7條件下經柱層析、重結晶分離到1個單體化合物。該物質為淡黃色粉末，1H NMR(CD3OD-d4，400 MHz)δ:7.16(d，J=1.6 Hz，1H ，H-2)，，7.15(d，J=1.6 Hz，1H，H-6)，3.87(s，3H，3-OCH3)，3.86(s，3H，4-OCH3)，3.84(s，3H，8-OCH3);13C NMR(CD3OD-d4，100 MHz)δ:126.5(C-1)，111.9(C-2)，151.6(C-3)，142.0(C-4)，154.4(C-5)，105.9(C-6)，168.3(C-7)，51.9(C-8)，55.8(C-9)，59.9(C-10)。其波譜數據與文獻中數據對照一致［6］，故鑒定為3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯，分子式為C10H12O5。

圖1 3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的化學結構Fig.1 Chemical structure of 3，4-dimethoxy-5-hydroxy benzoic acid methyl ester

2.2 H2O2氧化損傷模型的建立

為明確沒食子酸酯類物質對神經細胞的抗氧化保護作用，我們先構建了H2O2對SH-SY5Y細胞的氧化損傷模型。結果顯示隨著H2O2濃度的增加，SH-SY5Y細胞的損傷作用越明顯，細胞存活率逐漸降低。800 μmol/L H2O2能導致約60%的SH-SY5Y細胞死亡(存活率41.6%)，因此選用此濃度的H2O2建立了穩定的氧化損傷模型(圖2、圖4)。

圖2 H2O2對SH-SY5Y細胞存活率的影響，＊＊ P＜0.01，n=5。Fig.2 Influence of H2O2concentrations on viability rate of SH-SY5Y cells，＊＊ P ＜0.01，n=5.

2.3 沒食子酸酯系列化合物對SH-SY5Y細胞的毒性評價

由于沒食子酸酯系列化合物對神經細胞具有潛在的毒性，試驗中我們考察了這些不同濃度的單體對SH-SY5Y細胞存活率的影響。結果顯示(表1)二甲氧酯、沒食子酸正丙酯和沒食子酸異戊酯在較低濃度(6.25 μg/mL)時可促進SH-SY5Y細胞的生長，其它沒食子酸酯化合物隨著濃度的增加，對SHSY5Y細胞的毒害作用加強。在0～25 μg/mL濃度范圍內，沒食子酸酯系列化合物對SH-SY5Y細胞的毒害作用較小，選用此濃度范圍進行沒食子酸酯系列化合物抗氧化保護作用分析。

表1 沒食子酸酯對SH-SY5Y細胞的生長抑制作用Table 1 Influence of gallate esters on growth of SH-SY5Y cells

2.4 沒食子酸酯抗氧化保護作用分析

為了探究沒食子酸酯系列化合物對雙氧水所致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用，本文特采用空白組，模型組，給藥組三種處理方式，給藥組加入不同濃度梯度(1.063、3.125、6.25、12.5 和 25 μg/mL)的沒食子酸酯類。將三種處理方式的OD492進行比較，分析沒食子酸酯系列化合物對神經細胞氧化損傷的保護作用(圖3和4)。

實驗結果表明，二甲氧酯、沒食子酸乙酯、正丙酯、異戊酯加藥后，細胞存活率有明顯提升，說明對神經細胞都有顯著的抗氧化保護作用，可以將皺縮的細胞恢復成近伸展的狀態，而沒食子酸正辛酯對雙氧水所致SH-SY5Y細胞損害的保護作用并不明顯(圖3、圖4)。另外，不是所有的抗氧化保護作用都有濃度依賴性，其中二甲氧酯和沒食子酸乙酯的最適濃度為為6.25 μg/mL，但是神經細胞卻對沒食子酸丙酯和異戊酯的濃度顯得并不敏感。尤其需要指出的是，與廣泛使用的抗氧化劑沒食子酸正丙酯相比較，二甲氧酯和沒食子酸乙酯的保護作用也相當突出，表明其可作為潛在的抗氧化劑而廣泛使用。

圖3 沒食子酸酯類化合物對SH-SY5Y細胞的氧化損傷保護作用Fig.3 Oxidative damage protection of gallate esters to SH-SY5Y cells

圖4 過氧化氫致SH-SY5Y細胞氧化損傷及沒食子酸酯類化合物的保護作用(×200)Fig.4 Oxidation injury induced by H2O2and theprotection effects of gallate esters to nerve cells(×200)

3 討論

在許多退化性神經系統疾病中，都涉及到活性氧能誘導的細胞凋亡，因此保護神經元免受氧化應激損傷，是防治該類疾病的有效手段之一。目前，治療神經退行性疾病的主要臨床藥物大多為生物堿類結構，本文在構建了過氧化氫對神經細胞的氧化應激模型后，探討了不同沒食子酸酯類的抗氧化保護作用，實驗結果表明大多沒食子酸酯類都對神經細胞有一定的抗氧化保護作用，為神經退行性疾病的藥物設計提供了一定的參考價值。

由于沒食子酸正丙酯是一種廣泛使用的抗氧化劑，此外它還有有抗血小板聚集、抗炎、逆轉恢復受損神經細胞等作用，在醫藥和食品工業中得到極大的關注。然而本文從三峽流域特有瀕危植物疏花水柏枝中分離到的一種天然產物，即3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯，為沒食子酸甲酯的衍生物，卻對神經細胞顯示出比沒食子酸正丙酯更好的抗氧化保護作用，表明其有潛在的藥用價值。

但是沒食子酸正辛酯有點例外，與實驗中所用的其他沒食子酸酯類相比，其抗氧化保護作用很小，可能與其本生的毒性作用較大有關，因此是否由于其參與成酯的烴基較大，影響了細胞的正常生長，從而降低了它的抗氧化作用，這有待于進一步研究。

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