硫脲殼聚糖銅配合物與鯡魚精DNA相互作用的研究

李小芳，馮小強*，楊 聲

1天水師范學院生化學院，天水 741001;2定西師專，定西 743000

DNA是生命中重要的遺傳物質，同時也是很多藥物的靶點。藥物與DNA相互作用的研究不僅有助于揭示藥物的作用機理，同時對于新藥的研發也具有重要的意義［1］。銅離子具有抗炎、殺菌、抗癌、抗凝血等藥理作用。許多生物酶都依靠與銅元素的反應來激發活性，從而完成在生物體中對新陳代謝過程的催化作用。因此，銅配合物的合成及生物活性的研究成為一個焦點領域。硫脲殼聚糖銅(Thiourea-chitosan-Cu，簡稱 TUCS-Cu)，對 E．coli和 St．aureus具有顯著的抑菌性能［2］。為了揭示其抑菌機理，探討TUCS-Cu與DNA作用模式及其生物活性之間的關系，有助于人們對TUCS-Cu與DNA相互作用方式的理解，同時在分子和細胞水平上研究病因尋找具有抗腫瘤活性的藥物有著重要的意義［3］，為研究TUCS-Cu在基因治療領域的應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

TUCS-Cu(制備方法見參考文獻［2］)，用 1.0%(v/v)HAc溶解;鯡魚精DNA美國Sigma公司產品，配制0.1 mg/mL貯備液備用。UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津);CHI660B電化學工作站(上海辰華)。

1.2 實驗方法

1.2.1 循環伏安行為

實驗在單室電解池中進行，三電極系統:工作電極為玻碳電極(GCE)，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑絲電極。

1.2.2 紫外吸收光譜

在1 cm×1 cm比色皿中加入0.1 mg/mL的DNA溶液 4 mL，用 TUCS-Cu滴定，搖勻，放置 5 min，以試劑空白為參比，掃描吸收光譜。滴定時每次加入體積為5 μL。

1.2.3 熒光光譜

比色皿中加入0.1 mg/mL的DNA溶液3 mL和NR溶液0.05 mL，用TUCS-Cu溶液進行滴定，以550 nm為激發波長，EX=EM=5 nm，測定熒光光譜。滴定時每次加入體積為5 μL。

1.2.4 粘度測定

DNA溶液粘度用烏氏粘度計測定，測定時固定DNA濃度為0.1 mg/mL，以不同的R(CTUCS-Cu/CDNA)加入配合物，溫度恒定在25℃，作用30 min進行測量，得到(η/η0)1/3與配合物濃度關系。η為 DNA溶液在加入配合物時的粘度，η0為DNA溶液的粘度。

2 結果與討論

2.1 TUCS-Cu與DNA作用的循環伏安行為

圖1 掃速對TUCS-Cu電化學影響Fig.1 Effect of scan rate on the electrochemistry of TUCS-Cu

在0.1v/s的掃描速度下，TUCS-Cu在-0.2V附近有一還原峰，在0.258V和0.506V處有兩個氧化峰，分別對應于Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)的氧化峰。從不同掃描速度下獲得的循環伏安圖可見(圖1a)，氧化還原峰電流隨著掃描速度的增大而增大(0.01～0.15v/s)，并與掃描速度的平方根呈現很好的線性關系y=1.05+8.56x(R=0.9979)(圖1b)，表明中心銅離子在電極上的反應過程主要由擴散過程控制。

在4 mL 1.0 mg/mL的 TUCS-Cu溶液中，用DNA滴定，每次加入體積為10 μL，搖勻，放置 5 min，TUCS-Cu與DNA在稀溶液中相互作用的循環伏安曲線如圖2所示。發現在配合物溶液中加入DNA后，循環伏安曲線發生了明顯的變化，TUCS-Cu配合物的氧化峰電流明顯降低且沒有新的氧化還原峰出現，氧化還原峰電流急劇降低，且在0.506V的氧化峰電位發生正移，故峰電位差ΔE增大。Bard等提出，當金屬配合物與DNA發生作用時，如果峰電位向負方向偏移，則金屬配合物與DNA發生靜電作用，如果峰電位向正方向偏移，則發生插入作用［4］，說明TUCS-Cu以嵌插作用與DNA分子作用形成了非電活性化合物［5］。由于該非電活性化合物在電極上沒有電化學響應，而配合物與DNA相互作用導致溶液中游離配合物分子的濃度降低，使得單位時間內遷移到電極表面的配合物分子數量減少或擴散速度減小，從而導致峰電流減小。

圖2 TUCS-Cu與DNA作用的循環伏安圖Fig.2 Cyclic voltammetry figure of TUCS-Cu with DNA

2.2 TUCS-Cu與DNA相互作用的紫外吸收光譜

加入TUCS-Cu后，DNA體系的吸收光譜如圖3所示。DNA在258 nm處有最大吸收峰，TUCS-Cu對DNA吸收光譜產生了明顯的增色效應，且最大吸收波長紅移至275 nm附近，說明TUCS-Cu與DNA發生了相互作用。根據Long理論，增色效應，最大吸收波長發生紅移是該物質與DNA發生嵌插作用的標志［6］。明顯的增色效應說明TUCS-Cu與堿基對之間的距離很近，即TUCS-Cu可能插入到DNA的堿基對中，從而引起DNA堿基對與嵌插的TUCSCu分子間產生較強的電子相互作用。

圖3 TUCS-Cu對DNA紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of TUCS-Cu on the UV absorption spectra of DNA

圖4 TUCS-Cu對NR-DNA熒光光譜的影響Fig.4 Effect of TUCS-Cu on the fluorescence spectra of NR-DNA

2.3 TUCS-Cu與DNA相互作用的熒光光譜

中性紅(NR)為一共軛平面稠環分子，能專一性地插入DNA雙螺旋的堿基對之間，使熒光顯著增強。TUCS-Cu存在下DNA-NR體系熒光強度的變化如圖5所示。TUCS-Cu在此條件下無熒光，TUCS-Cu對DNA-NR體系熒光具有增強效應。熒光通常是發生于具有剛性平面結構的π-電子共軛的分子中，隨著π-電子共軛度和分子平面度的增大，熒光效率也將增強。分子共平面性越大，π-電子共軛度越大;即任何有益于提高π-電子共軛度的結構改變，都將提高熒光效率。說明TUCS-Cu的熒光與NR類似，它能專一地嵌入DNA雙螺旋的堿基對之間，使熒光顯著增強，進一步說明了TUCS-Cu是以插入方式與DNA發生作用。

2.4 DNA溶液的粘度

圖5 不同濃度TUCS-Cu對DNA粘度的影響Fig.5 Effects of increased amounts of TUCS-Cu on the viscosity of DNA

粘度一般被認為是確定配合物與DNA結合模式最有力的證據。當TUCS-Cu存在時，DNA的相對粘度降低，且隨配合物濃度的增大呈現降低的趨勢，如圖5所示，表明TUCS-Cu與DNA發生了相互作用，這種插入方式使DNA得雙螺旋發生扭結，導致其粘度降低［7］。

3 結論

采用循環伏安、紫外光譜和熒光光譜法研究了TUCS-Cu與鯡魚精DNA的相互作用。結果表明，TUCS-Cu與DNA之間存在嵌插作用，而生成一種非電活性超分子復合物。

1 Smits KM，Schouten JS，Smits LJ，et al.A review on the design and reporting of studies on drug-gene interaction.J Clin Epidemiol，2005，58:651-654.

2 Li XF(李小芳)，Feng XQ(馮小強)，Yang S(楊聲)，et al.preparation，Characterization and antibacterial activity of Thiourea-chitosan-copper(II)complex.Food Sci(食品科學)，2011，32(7):57-60.

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4 Zhang F(張芳)，Zhang QQ(張前前)，Zhu CJ(祝成堅)，et al.Synthesis and DNA binding spectroscopy studies of Cu(II)-Thr-Phen.Spectro Spectral Anal(光譜學與光譜分析)，2005，25:1439-1442.

5 Pasternack PF，Gibbs FJ，Villatrnaca J.Interactions of porphyrins with nucleic acids.J Biochem，1983，22:2406-2414.

6 Long EC ，Barton JK.On demonstrating DNA inter-calation．Acc Chem Res，1990，23:273-281.

7 Liu J，Lu TB，Li H，et al.DNA-bing and cleavage studies of a dinuclear copper(II)complex with a 26-membered exazamacrocycle.Transit Met Chem，2002，27:686-690.