銀杏葉提取物的Py-GC-MS分析及其在卷煙中的應(yīng)用

蔣國斌，徐 莉，李國政，雷 萌，王燕芹，陳 泳，唐 穎

1南京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院;2南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院;3南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心，南京 210037;4河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州 450016

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的干燥葉，具有較高的生物活性和藥用價(jià)值。銀杏葉提取物(Ginkgo biloba leaves extract，EGB)成分復(fù)雜，主要含黃酮類、內(nèi)酯類、原花青素類等，具有廣泛的藥理作用，臨床用于預(yù)防和治療心腦血管疾病。德國施瓦伯(Schwabe)公司生產(chǎn)的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物EGB761享譽(yù)世界，其丙酮-水專利工藝提取的EGB761主要組分見表1［1，2］。銀杏葉黃酮和內(nèi)酯是重要的生理活性物質(zhì)，黃酮能夠擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量，增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力，降血壓，降血脂，萜內(nèi)酯是高選擇性的血小板活化因子拮抗劑;銀杏葉黃酮、原花青素還是有效的天然自由基清除劑，以優(yōu)越的抗氧化性和較小的副作用應(yīng)用于功能食品、保健品和化妝品中［3-5］。近幾十年圍繞著治療心腦血管疾病，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)EGB進(jìn)行了廣泛深入的研究，但在其它領(lǐng)域的應(yīng)用如在卷煙中的應(yīng)用研究較少。

卷煙煙氣中含有多種有害物質(zhì)，如煙堿、CO、焦油、醛等，同時(shí)含有大量對(duì)人體有害的自由基。在燃吸過程中，煙絲和煙用添加劑中的化學(xué)成分經(jīng)歷蒸餾、裂解、聚合、燃燒、冷凝等一系列反應(yīng)，其中裂解是卷煙燃燒過程的重要環(huán)節(jié)。研究卷煙添加劑在煙氣中的裂解行為及裂解產(chǎn)物，有助于了解卷煙添加劑和煙絲化學(xué)成分在卷煙燃燒過程中遷移轉(zhuǎn)化機(jī)理［6］。熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜(Py-GC-MS)方法是模擬卷煙燃燒過程的有效手段，廣泛用于植物提取物及單體物質(zhì)的燃燒裂解產(chǎn)物研究。黃酮類化合物在銀杏葉提取物中含量較高，也是煙草中主要的多酚類物質(zhì)［7］，是煙草中重要的前體物質(zhì)［8］和潛香類物質(zhì)［9］，燃燒能產(chǎn)生多種香味物質(zhì)。鹿洪亮［10］提取銀杏葉中的揮發(fā)油后進(jìn)行了熱裂解產(chǎn)物研究并將其應(yīng)用于卷煙中，發(fā)現(xiàn)能與煙香協(xié)調(diào)，提高香氣質(zhì)，增大香氣量，余味有所改善。目前，大部分熱裂解研究是在無氧氛圍中進(jìn)行，近年來研究人員開始嘗試在有氧氛圍中進(jìn)行裂解。

表1 銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物EGB761中不同類別組分Table 1 Different classes of compounds presented in the standardised Ginkgo extract EGB761

本試驗(yàn)運(yùn)用Py-GC-MS法分析EGB的有氧熱裂解產(chǎn)物，通過加香試驗(yàn)對(duì)EGB卷煙進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，為黃酮類物質(zhì)及植物提取物在卷煙燃燒過程中的轉(zhuǎn)化行為提供參考，為銀杏葉提取物在卷煙中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與樣品

CDS5200熱裂解儀(美國CDS公司);Agilent 7890A/5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國Agilent公司);Waters E2695 HPLC色譜儀(美國 Waters公司);Precisa XS-225A-SCS電子天平(感量:0.001g，瑞士Precisa公司)。

EGB粉末，批號(hào)TYG120413，西安天一生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熱裂解試驗(yàn)

稱取0.001(±0.0002)g干燥EGB樣品，置于裂解儀專用石英管中，兩端用石英棉堵塞，然后裝入熱裂解儀鉑金探頭中進(jìn)行熱裂解，裂解完畢后鉑金探頭用高溫(1200℃)累計(jì)清洗2 min。所有裂解試驗(yàn)平行兩次。

1.2.1.1 熱裂解條件

裂解氛圍為空氣;初始溫度為50℃，保持1 s，以10℃/ms的速率分別升至300、600、800、900℃，保持20 s;熱裂解產(chǎn)物直接導(dǎo)入GC/MS中進(jìn)行分析。

1.2.1.2 吸附阱條件

吸附溫度為60℃，解吸附溫度為250℃，解吸附2 min。

1.2.1.3 GC條件

色譜柱:HP-Innowax毛細(xì)管柱(30 m×0.250 mm i.d.，0.25 μm d.f.);進(jìn)樣口溫度為 250 ℃;分流比為10∶1;載氣為He;流速為1 mL/min;升溫程序?yàn)?初始溫度為50℃，保持4 min，以5℃/min的速率升至220℃，保持2 min。

1.2.1.4 MS條件

EI離子源溫度:230℃;四極桿溫度:150℃;電離能:70 eV;掃描模式:全掃描;掃描質(zhì)量范圍:35～450 amu;溶劑延遲:2 min。采用NIST05a標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索定性，總離子流圖峰面積歸一化法半定量。

1.2.2 加香試驗(yàn)

稱取EGB粉末1 g，完全溶于100 mL無水乙醇，形成10 mg/mL的EGB溶液。分別量取0、2.5、5、10 mL溶液，無水乙醇定容至50 mL，用噴霧器分別噴灑在100 g黃金葉煙絲上。噴灑完畢后存放過夜使煙絲充分吸收溶液，低溫干燥后制成卷煙，恒溫(22±1℃)恒濕(相對(duì)濕度60% ±2%)環(huán)境下平衡48 h，以未加EGB的卷煙為對(duì)照，由鄭州中煙工業(yè)公司技術(shù)中心評(píng)吸小組評(píng)價(jià)比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGB質(zhì)量控制

將EGB樣品溶于90%乙醇溶液中，用HPLC按照指定方法［11］檢測黃酮醇苷、萜內(nèi)酯、酚酸含量，結(jié)果黃酮醇苷含量29.87%(≥24%)，萜內(nèi)酯含量6.14%(≥6%)，酚酸含量0.4 ppm(≤1 ppm)，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 GC升溫程序優(yōu)化

本試驗(yàn)對(duì)GC升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化。選定色譜柱后，將升溫速率設(shè)為5℃/min，終溫250℃，發(fā)現(xiàn)譜圖后期基線漂移，將升溫速率調(diào)整為4℃/min后基線較平穩(wěn)，但運(yùn)行時(shí)間較長，且45 min后無出峰，故將終溫調(diào)整為220℃，保持2 min。觀察總離子流圖發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間在3～6 min之間的幾個(gè)峰分離不好，將初始溫度保持時(shí)間由2 min延長至4 min后解決了這一問題。

2.3 熱裂解氛圍的選擇

一般認(rèn)為典型的卷煙燃燒過程中，分成3個(gè)主要反應(yīng)區(qū):靠近抽吸端的低溫冷凝區(qū)溫度低于100℃，中溫裂解蒸餾區(qū)溫度在400～600℃，高溫燃燒區(qū)溫度通常600～900℃［12］，平均燃燒溫度約為800℃。卷煙的燃燒主要是在有氧的環(huán)境下進(jìn)行，無氧氛圍下進(jìn)行的熱裂解試驗(yàn)與卷煙有氧燃燒的大氣環(huán)境有較大差異。600～900℃的燃燒區(qū)，處于富氧狀態(tài)，主要發(fā)生的是氧化反應(yīng)，用Py-GC/MS聯(lián)用技術(shù)模擬卷煙燃燒，空氣氛圍下得到的裂解產(chǎn)物類型更接近燃燒區(qū)［13］。近年來熱裂解主要停留在無氧氛圍，有氧氛圍中進(jìn)行裂解的報(bào)道較少，本試驗(yàn)選用空氣為裂解氛圍。

2.4 熱裂解條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)研究了裂解最終溫度持續(xù)時(shí)間對(duì)裂解產(chǎn)物的影響，選用800℃為最終溫度，裂解速率10℃/ms，將終溫持續(xù)時(shí)間分別設(shè)為 5、10、15、20、30 s，其它條件一致，結(jié)果不同終溫持續(xù)時(shí)間下得到樣品的總離子流圖(TIC)能較好地吻合，隨著終溫持續(xù)時(shí)間增長，譜圖豐度值不斷增大，到20 s時(shí)基本不再增加，說明EGB 20 s已能裂解完全，因此選定20 s為裂解持續(xù)時(shí)間。

2.5 熱裂解產(chǎn)物的總離子流圖

在煙用添加劑的熱裂解研究中，一般選取卷煙具有代表性的3個(gè)溫度300、600、900℃作為裂解溫度，分別代表揮發(fā)性物質(zhì)開始進(jìn)入煙氣、煙草開始燃燒和抽吸時(shí)最高溫度［14］。800℃是卷煙正常抽吸時(shí)的平均燃燒溫度，因此本試驗(yàn)選擇300、600、800、900℃作為熱裂解溫度對(duì)EGB裂解產(chǎn)物進(jìn)行考察，產(chǎn)物的總離子流圖見圖2。

圖2 不同溫度下EGB熱裂解產(chǎn)物的TIC圖(豐度值/保留時(shí)間)Fig.2 TICs of EGB pyrolysis products at different temperature(Abundance value/Retention time)

可以看出，不同溫度下EGB的裂解產(chǎn)物成分和含量變化較大，隨著溫度的不斷升高，裂解產(chǎn)物數(shù)量明顯增多，成分變得復(fù)雜，含量差異較大。

2.6 熱裂解產(chǎn)物的種類和含量

利用NIST05a標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，對(duì)EGB在300、600、800、900℃下裂解產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，并用峰面積歸一化法對(duì)各裂解產(chǎn)物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)定量，為提高方法的可靠性，所有裂解試驗(yàn)平行兩次取平均值，所有檢測結(jié)果與平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值均小于6%［13］，匹配度85%以上的產(chǎn)物名稱及質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表2。

表2 不同溫度下EGB的熱裂解產(chǎn)物Table 2 EGB pyrolysis products at different temperature

22.10 萘Naphthalene C10H8 91 - - 0.64% 2.24%23.45 3-甲基-2-丁烯酸 2-Butenoic acid，3-methyl- C5H8O2 92 - 0.35% - -24.10 甲基環(huán)戊烯醇酮Methylcyclopentenolone C6H8O2 90 1.17% 0.89% 0.78% 0.38%24.79 愈創(chuàng)木酚Guaiacol C7H8O2 94 2.30% 1.52% 0.91% -25.84 β-苯乙醇 β-Phenylethyl alcohol C8H10O 89 - 0.64% 0.51% -26.44 2-苯氧基乙醇2-Phenoxyethanol C8H10O2 87 0.90% - - -26.74 2-甲氧基-5-甲基-苯酚 Phenol，2-methoxy-5-methyl- C8H10O2 94 8.18% 4.08% 4.32% 3.18%26.93 2-甲氧基-4-甲基-苯酚 Phenol，2-methoxy-4-methyl- C8H10O2 87 2.41% 1.82% 1.12% 1.31%27.352-甲基-2，3-二氫-1-茚酮 1H-Inden-1-one，2，3-dihydro-2-methyl-C10H10O 91 4.06% - - -27.72 α-二氫茚酮 α-Hydrindone C9H8O 90 8.85% - - -27.77 苯酚Phenol C6H6O 93 3.70% 8.93% 7.64% 5.41%27.99 氨基甲酸苯酯 Carbamic acid，phenyl ester C7H7NO2 87 - 0.54% 0.20% -28.19 4-乙基-2-甲氧基-苯酚 Phenol，4-ethyl-2-methoxy- C9H12O2 91 8.50% 3.17% 2.42% 2.62%29.24 對(duì)甲苯酚p-Cresol C7H8O 96 13.36% 8.42% 6.64% 5.39%29.38 3-甲基-苯酚 m-Cresol C7H8O 92 4.85% 2.60% 1.41% 1.13%30.79 異丁香酚Isoeugenol C10H12O2 96 2.63% 1.89% 0.78% -30.97 4-乙基-苯酚 Phenol，4-ethyl- C8H10O 91 6.54% 4.64% 1.96% 2.33%31.35 4-乙烯基愈創(chuàng)木酚4-vinylguaiacol C9H10O2 95 9.96% 7.30% 3.07% 4.96%32.61 2，6-二甲氧基-苯酚 Phenol，2，6-dimethoxy- C8H10O3 88 2.64% 1.70% 1.18% 1.07%32.99 5-羥基-麥芽酚5-Hydroxymaltol C6H6O4 86 2.20% - - -33.87 佳味酚Chavicol C9H10O 89 0.31% 0.20% 0.17% -34.01 丁香酚Eugenol C10H12O2 97 1.92% 1.31% 0.91% -35.64 吲哚Indole C8H7N 91 1.25% 0.22% - -37.57 香蘭素Vanillin C8H8O393 1.49% - - -

由表2可知，EGB 在300、600、800、900 ℃下依次鑒定出22、42、47、39種裂解產(chǎn)物，共58種產(chǎn)物，不同溫度下的產(chǎn)物成分和含量變化較大，低溫300℃產(chǎn)生較多的致香物質(zhì)，高溫800～900℃則出現(xiàn)少量有害物質(zhì)。EGB在不同溫度下裂解主要生成烴類、酮類、醇類、醛類、酚類、呋喃類、酸類、芳香族化合物及其衍生物。不同溫度下EGB發(fā)生不同程度的化學(xué)鍵斷裂和反應(yīng)，低溫下只發(fā)生簡單裂解生成多種苯環(huán)衍生物如苯乙烯、苯甲酸等，高溫下進(jìn)一步裂解破壞生成更復(fù)雜產(chǎn)物。

300℃時(shí)裂解產(chǎn)物數(shù)量較少，其中香味物質(zhì)較多，為醛、酮、酚、醇、酯類物質(zhì)，如 5-甲基-2-糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮、愈創(chuàng)木酚、2-苯氧基乙醇、對(duì)甲苯酚、異丁香酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、5-羥基-麥芽酚、丁香酚、香蘭素等，單一成分含量最高的對(duì)甲苯酚為13.36%。

600℃時(shí)裂解產(chǎn)物數(shù)量急劇增多，上述香味物質(zhì)基本存在，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本持平，其中5-甲基-2-糠醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等香味物質(zhì)均有不同程度的減少;同時(shí)生成了多種烷烴類、醛類、酮類和呋喃類物質(zhì)，其中也有α-松油烯、苧烯等香味物質(zhì)。600℃單一成分最高的苯酚含量為8.93%。

800℃時(shí)裂解產(chǎn)物數(shù)量進(jìn)一步增加，至900℃略有減少，其中香味物質(zhì)大量減少，如異丁香酚、香蘭素等基本消失，出現(xiàn)了一些苯系物、多環(huán)芳烴類有害物質(zhì)，如苯、甲苯、二甲苯、萘、1，2，4-三甲基-苯等，這些物質(zhì)均在著名的Hoffmann名單或加拿大衛(wèi)生部卷煙煙氣有害成分名單［8］之中。900℃單一成分最高的仍然是苯酚，含量升降至5.41%。

2.7 致香產(chǎn)物的分布規(guī)律

EGB所有58種裂解產(chǎn)物中有23種致香物質(zhì)。這些物質(zhì)有著各自獨(dú)特的嗅覺特征，具有定香和助香作用，能夠提高卷煙的香氣，是食品、煙草等行業(yè)重要的香料和添加劑(見表3)。由圖3、圖4可以看出，300℃時(shí)EGB的裂解產(chǎn)物較少，但致香物質(zhì)比例較高，占產(chǎn)物總數(shù)的54.5%，隨著溫度的升高，裂解產(chǎn)物種類不斷增多，但致香物質(zhì)所占的比例不斷降低，900℃時(shí)降為最低的25.6%。經(jīng)計(jì)算，如圖4所示，裂解產(chǎn)物中香味物質(zhì)占總產(chǎn)物質(zhì)量百分比隨著溫度亦呈現(xiàn)下降趨勢，300℃時(shí)最高為40.7%，600℃時(shí)為39.7%，800℃時(shí)降為25.6%，900℃時(shí)降至最低18.4%。

表3 EGB熱裂解產(chǎn)物中的香味物質(zhì)Table 3 Flavoring substances of EGB pyrolysis products

圖3 不同溫度下EGB裂解產(chǎn)物及致香產(chǎn)物數(shù)量分布Fig.3 Quantity of EGB pyrolysis products and flavoring substances at different temperatures

圖4 不同溫度下EGB致香產(chǎn)物數(shù)量及質(zhì)量比例Fig.4 Quantity and mass fraction of EGB pyrolysis flavoring substances at different temperatures

EGB裂解23種致香產(chǎn)物中，所占質(zhì)量比重較大的分別為對(duì)甲苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、α-松油烯、5-甲基-2-糠醛、愈創(chuàng)木酚、甲基環(huán)戊烯醇酮、苯乙烯。圖5選取了這幾種代表性致香物質(zhì)，不難發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物總體呈現(xiàn)隨著裂解溫度升高相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降的趨勢。其中5-甲基-2-糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮、對(duì)甲苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在各個(gè)裂解溫度中均存在，但含量有差別，含量隨著溫度升高而降低。α-松油烯和苯乙烯在低溫300℃時(shí)檢測不到，α-松油烯在600℃釋放量急劇增加;而愈創(chuàng)木酚、甲基環(huán)戊烯醇酮在高溫900℃基本檢測不到。

圖5 EGB部分致香產(chǎn)物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度變化Fig.5 Relative mass fraction of some EGB pyrolysis flavoring substances varied with the changing of temperature

2.8 裂解產(chǎn)物中的有害物質(zhì)

EGB在裂解過程中，特別是在高溫下會(huì)產(chǎn)生一些苯系物、多環(huán)芳烴類有害物質(zhì)，如苯、甲苯、對(duì)二甲苯、萘、1，2，4-三甲基苯、苯并呋喃等，含量總和比重為7.63%，含量最高的為苯5.26%。圖6選取了上述幾種有害物質(zhì)，可以看出這些物質(zhì)在裂解產(chǎn)物中含量較低，很多僅在高溫時(shí)產(chǎn)生，低溫300℃都無釋放。其中苯和甲苯含量較高，但僅在高溫800～900℃才開始生成，對(duì)二甲苯、萘也在800℃開始生成，1，2，4-三甲基苯、苯并呋喃在600℃開始生成，含量低于1%。

圖6 EGB裂解產(chǎn)物中幾種有害物質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度變化Fig.6 Relative mass fraction of some EGB pyrolysis harmful substances varied with the changing of temperature

2.9 EGB卷煙的感官質(zhì)量評(píng)價(jià)

由于卷煙燃燒的復(fù)雜性，上述熱裂解試驗(yàn)是對(duì)卷煙真實(shí)吸燃情況的模擬，將EGB溶液加入煙絲中制成卷煙進(jìn)行感官評(píng)吸，將更有助于評(píng)價(jià)EGB裂解產(chǎn)物對(duì)卷煙抽吸品質(zhì)的實(shí)際影響。

按1.2.2所述方法，分別加入質(zhì)量濃度0.025%、0.05%、0.1%、0.5%EGB制成卷煙對(duì)其加香效果進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果表明(見表4):加樣量為0.025～0.05%時(shí)，煙絲光澤油潤，無異味，能不同程度地增加香氣質(zhì)和香氣量、減少雜氣和刺激性、提高舒適度，其中加入0.025%時(shí)效果較好。當(dāng)加樣量為0.5%時(shí)，對(duì)卷煙感官質(zhì)量有一定的降低作用。

表4 EGB不同加樣量的感官質(zhì)量評(píng)價(jià)Table 4 Sensory quality evaluation of different adding amount of EGB sample

3 結(jié)論

EGB在不同溫度下裂解產(chǎn)物共58種，主要為烴類、酮類、醇類、酸類、醛類、酚類、呋喃、芳香族化合物及其衍生物，300、600、800、900 ℃下依次鑒定出22、42、47、39種裂解產(chǎn)物，不同溫度下的產(chǎn)物成分和含量變化較大。裂解產(chǎn)物中香味物質(zhì)數(shù)量達(dá)23種，如5-甲基-2-糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮、愈創(chuàng)木酚、2-苯氧基乙醇、對(duì)甲苯酚、異丁香酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、5-羥基-麥芽酚、丁香酚、香蘭素等，它們具有天然的芳香氣味，具有定香和助香作用，能夠提高卷煙的香氣。這些香味物質(zhì)在低溫300～600℃時(shí)含量較高，隨著溫度升高而降低，至900℃時(shí)基本消失，產(chǎn)生少量苯系物、多環(huán)芳烴、呋喃類等有害物質(zhì)。

EGB裂解產(chǎn)中香味物質(zhì)種類及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)所占比例均隨著溫度升高不斷降低，所占質(zhì)量比重較大的分別為對(duì)甲苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、α-松油烯、5-甲基-2-糠醛、愈創(chuàng)木酚、甲基環(huán)戊烯醇酮、苯乙烯。EGB裂解產(chǎn)生的苯、甲苯、對(duì)二甲苯、萘、1，2，4-三甲基苯、苯并呋喃等有害物質(zhì)相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，很多僅在高溫時(shí)產(chǎn)生。

選用研究較少的有氧氛圍進(jìn)行熱裂解。卷煙的燃燒主要是在有氧的環(huán)境下進(jìn)行，空氣氛圍檢測結(jié)果與卷煙實(shí)際燃燒的大氣環(huán)境更接近更科學(xué)。通過運(yùn)用模擬卷煙燃燒常用手段Py-GC-MS法進(jìn)行EGB熱裂解，為研究其它黃酮類物質(zhì)、植物提取物在卷煙燃燒中轉(zhuǎn)化行為提供參考，為銀杏葉提取物在卷煙中的應(yīng)用提供依據(jù)。將不同濃度的EGB加入煙絲中制成卷煙進(jìn)行感官評(píng)吸，發(fā)現(xiàn)加樣量為0.025%時(shí)，能增加香氣質(zhì)和香氣量，減少雜氣和刺激性，提高舒適度，效果較好。

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