芹菜素對小鼠血清性激素和精子活動度影響的劑量效應研究

汪燕妮，黨瑜慧，劉佳微，吳 雙，劉玲飛，李芝蘭

蘭州大學公共衛生學院，甘肅 730000

目前，絕大多數的避孕措施都主要以女性使用為主，特別是避孕藥物的使用。到目前為止，我國國內尚未見到一種效果好、低副作用、被廣泛認可的男性避孕藥物。芹菜素作為一種天然存在的植物黃酮，廣泛存在于各類水果、蔬菜和豆類中，特別是芹菜中含量最為豐富。研究證明具有抗氧化功能、抑制致癌物質、抗炎等多種生物學和藥理學作用［1-3］。

有研究顯示健康成年男性每日攝食芹菜75 g，連續1～2周后，精子數量會明顯減少到難以受孕的程度，這種情況在停食芹菜后幾個月又會恢復正常［4］。但具體是芹菜中哪種成分在起關鍵作用尚未定論。本研究通過觀察芹菜素對成年雄性小鼠的血清睪酮(Testosterone，T)、雌二醇(Estradiol，E2)、雌二醇/睪酮(E2/T)以及精子密度和活動率的影響，探討芹菜素對生殖功能影響的機制，對進一步研究開發芹菜素的藥用價值提供一定的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康SPF級昆明種雄性小鼠120只，體重(28.20±3.55)g，周齡6～8周(甘肅中醫學院提供)，動物合格證號:SCXK(甘)2011-0001-0001067，實驗室設施使用證明號:SCXK(甘)2011-0001-0002756。

每天定時給予對照組0.01 mL/g bw生理鹽水灌胃，實驗組給予0.01 mL/g bw不同劑量(低劑量組252 mg/L，中劑量組504 mg/L，高劑量組1008 mg/L)的芹菜素混懸液灌胃。連續灌胃 7、14、21 d后分批內眥靜脈叢取血后脫臼處死小鼠，分離附睪、睪丸，分別稱重，計算臟器系數(臟器系數=臟器濕重/動物體重)。

1.2 儀器與材料

WLJY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統(北京偉力新世紀科技發展有限公司);JA3003 N電子秤(上海精密科學儀器有限公司);DK-600S型三用恒溫水浴箱(上海精宏實驗設備有限公司)。芹菜素購于陜西慧科植物開發有限公司，純度98%，灌胃時用蒸餾水配成所需濃度。睪酮、雌二醇放射免疫分析藥盒，JA3003N電子秤(上海精密科學儀器有限公司)，GC-1200γ放射免疫計數器。

1.3 分組與方法

將小鼠按體重隨機分為4組:陰性對照組(生理鹽水)、低劑量組(252 mg/L芹菜素)、中劑量組(504 mg/L芹菜素)和高劑量組(1008 mg/L芹菜素)，每組各30只。動物飼養在甘肅省中醫學院中心實驗室的SPF級實驗室內。每天定時給陰性對照組0.01 mL/g bw生理鹽水灌胃，各劑量組給予0.01 mL/g bw不同濃度的芹菜素灌胃，每天1次。連續灌胃7、14、21 d后分批小鼠內眥靜脈叢取血后脫臼處死小鼠，所取血液放入離心管采用低速離心機(3000 rpm，5～6 min)，靜置分層，吸取上層血清，采用放射免疫學方法(RIA)，利用GC-1200γ放射免疫計數器進行血清中睪酮(T)和雌二醇(E2)濃度的測定。分離附睪、睪丸，分別稱重，計算臟器系數(臟器系數=臟器濕重/動物體重)。左側附睪稱重后立即放入盛有1 mL 0.86%的生理鹽水平皿中，用眼科剪刀橫向剪開3個切口，放置37℃水浴箱中，30 min后用微量移液器吸取10 μL精子懸液，應用WL JY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統(CASA)測定精子密度、活動率等指標。

1.4 統計學處理

2 實驗結果

2.1 芹菜素對各組小鼠臟器系數的影響

經單因素方差分析，芹菜素7、14、21 d處理組，各劑量組睪丸系數、附睪系數與同期陰性對照組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，由表1可見。

表1 芹菜素對小鼠睪丸、附睪系數的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of apigenin on testis index and epididymis index(n=10，±s)

表1 芹菜素對小鼠睪丸、附睪系數的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of apigenin on testis index and epididymis index(n=10，±s)

天數Days分組Group睪丸濕重Testis wet weight睪丸系數Testis index(×10-3)附睪濕重Epididymis wet weight附睪系數Epididymis index(×10-3)7 d 對照組Negative control 0.18±0.05 6.71±1.96 0.06±0.02 2.33±0.50低劑量組Low-dose group 0.18±0.04 6.79±1.31 0.07±0.02 2.55±0.63中劑量組Medium-dose group 0.19±0.05 7.30±1.95 0.07±0.01 2.73±0.56高劑量組High-dose group 0.20±0.05 8.05±1.51 0.07±0.02 2.91±1.04 14 d 對照組Negative control 0.21±0.03 5.88±0.96 0.08±0.02 2.25±0.54低劑量組Low-dose group 0.27±0.20 6.42±1.08 0.08±0.01 2.20±0.37中劑量組Medium-dose group 0.21±0.04 6.79±1.11 0.08±0.02 2.38±0.51高劑量組High-dose group 0.21±0.03 6.30±1.13 0.08±0.01 2.28±0.33

21 d 對照組Negative control 0.22±0.05 5.73±1.25 0.09±0.02 2.22±0.36低劑量組Low-dose group 0.24±0.05 6.00±1.04 0.10±0.02 2.36±0.54中劑量組Medium-dose group 0.23±0.03 5.84±1.04 0.09±0.02 2.22±0.42高劑量組High-dose group 0.22±0.04 5.36±0.86 0.09±0.02 2.25±0.50

2.2 芹菜素對小鼠血清性激素的影響

小鼠血清T濃度7 d無明顯變化，14 d各劑量組均低于對照組(P=0.000)，高劑量組低于中劑量組和低劑量組(P＜0.05);21 d T濃度中、低劑量組都低于對照組(P＜0.05)。14 d小鼠血清T濃度隨芹菜素濃度增加出現一定的劑量效應關系。小鼠血清E2濃度7、14、21 d各劑量組之間差異無統計學意義。E2/T 14 d高劑量組高于中、低劑量組和對照組(P＜0.05)。其變化與14 d血清T濃度高劑量組明顯降低相一致。

表2 芹菜素對小鼠血清性激素的影響(n=10，±s)Table 2 Effect of apigenin on sex hormones(n=10，±s)

表2 芹菜素對小鼠血清性激素的影響(n=10，±s)Table 2 Effect of apigenin on sex hormones(n=10，±s)

注:與對照組比較 *P＜0.05;＊＊P ＜0.01;#:與低劑量組和中劑量組比較P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05;＊＊P ＜ 0.01;#:Compare with low-dose and medium-dose group P ＜ 0.05.

天數Days分組group T(ng/dl)E2(pg/mL) E2/T 7 d 對照組Negative control 10.57±4.85 7.64±3.24 0.67±0.29低劑量組Low-dose group 11.08±4.37 5.03±1.48 0.54±0.30中劑量組Medium-dose group 16.00±3.67 6.05±1.57 0.49±0.25高劑量組High-dose group 15.22±7.71 6.82±2.15 0.51±0.22 14 d 對照組Negative control 19.67±5.83 4.37±1.11 0.25±0.11低劑量組Low-dose group 12.69±6.18＊＊ 3.12±0.58 0.26±0.12中劑量組Medium-dose group 12.25±3.66＊＊ 5.39±1.49 0.35±0.09高劑量組High-dose group 7.61±1.46＊＊# 5.11±1.96 0.69±0.19*21 d 對照組Negative control 33.12±7.49 4.69±1.53 0.15±0.05低劑量組Low-dose group 19.36±8.37* 3.93±1.35 0.21±0.13中劑量組Medium-dose group 20.04±7.14* 2.63±1.41* 0.17±0.12高劑量組High-dose group 29.88±9.48 4.14±1.17 0.14±0.05

2.3 芹菜素對小鼠精子活動率的影響

14 d低、中、高劑量組的a級精子百分率低于同期陰性對照組，但差異無統計學意義。21 d低、中、高劑量組的a級精子百分率低于同期陰性對照組(P＜0.05)，表3。14、21 d各劑量組小鼠精子活力低于同期陰性對照組，但差異無統計學意義，表4。

表3 芹菜素對小鼠精子活動度影響(n=10，±s)Table 3 Impact of apigenin on mice sperm motility(n=10，±s)

表3 芹菜素對小鼠精子活動度影響(n=10，±s)Table 3 Impact of apigenin on mice sperm motility(n=10，±s)

天數Days分組Group n 精子運動狀態分布Grade of sperm(%)a b c d 7 d 對照組Negative control 10 7.92±5.18 8.51±5.78 32.30±15.28 51.28±22.93低劑量組Low-dose group 10 8.25±4.09 9.38±4.18 28.53±12.89 53.84±14.58中劑量組Medium-dose group 10 13.62±7.80 14.47±9.50 42.91±12.74 29.00±11.87高劑量組High-dose group 10 8.63±6.56 10.94±5.13 34.55±14.56 45.88±16.17 14 d 對照組Negative control 10 8.56±3.98 11.82±3.88 32.97±8.21 46.65±9.80低劑量組Low-dose group 10 5.98±1.93 10.20±4.24 40.25±6.24 45.58±7.64中劑量組Medium-dose group 10 6.88±3.84 8.92±3.23 35.60±10.01 48.37±12.44高劑量組High-dose group 10 7.44±4.57 12.40±4.24 37.14±11.21 43.02±12.58

注:與陰性對照組比較，*:P﹤0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

2.4 芹菜素對小鼠精子密度的影響

7、14、21 d小鼠精子密度各劑量組與同期對照 組比較差異均無統計學意義，見表4。

表4 芹菜素對小鼠精子密度及活動率的影響(n=10，±s)Table 4 Effect of apigenin on sperm density and motility ratio(n=10，±s)

表4 芹菜素對小鼠精子密度及活動率的影響(n=10，±s)Table 4 Effect of apigenin on sperm density and motility ratio(n=10，±s)

天數Days分組Group精子密度(×10-9)Sperm density(×10-9)精子活力(a+b%)級Grade a+b(%)精子活率(a+b+c%)級Grade a+b+c(%)7 d 對照組Negative control 1.26±0.42 16.05±10.82 48.72±22.93低劑量組Low-dose group 1.37±0.76 17.63±6.82 46.16±14.58中劑量組Medium-dose group 1.16±0.98 28.09±16.04 71.00±11.87高劑量組High-dose group 1.31±1.07 24.19±14.24 54.12±16.17 14 d 對照組Negative control 3.18±1.17 20.38±5.98 53.35±9.80低劑量組Low-dose group 3.11±0.33 16.18±5.40 54.42±7.64中劑量組Medium-dose group 2.57±0.94 16.02±5.21 51.63±12.44高劑量組High-dose group 2.46±0.94 19.84±8.31 56.98±12.58 21 d 對照組Negative control 3.35±1.00 19.51±8.18 65.74±11.47低劑量組Low-dose group 3.34±0.81 15.30±5.39 59.28±12.77中劑量組Medium-dose group 2.88±0.55 17.34±5.65 64.11±14.39高劑量組High-dose group 2.84±0.73 15.84±3.96 55.96±9.60

3 討論

目前，男性可采用的避孕和節育方法包括體外排精、陰莖套、安全期避孕法和輸精管結扎術。雖然激素避孕成功用于女性已有40余年，但男性激素避孕的研究直到近年才有所發展［5，6］，但至今在世界范圍內還沒有一種成熟的、市場化的男性避孕藥品。在傳統避孕藥的基礎上，利用植物活性物質開發安全、有效的避孕藥已經成為一種發展趨勢。研究發現，芹菜素作為一種天然物質，對男性的精子的生成具有明顯抑制作用［4］。本研究旨在針對芹菜素對精子質量影響的機制作進一步探討，進一步開發芹菜素的藥用價值。

臟器系數的變化可近似反映該臟器的功能狀態和病變情況。本實驗發現，芹菜素7、14、21 d各劑量組小鼠睪丸和附睪的臟器系數與陰性對照組比較無統計學意義，提示本實驗劑量的芹菜素對小鼠睪丸和附睪無明顯影響。

本次實驗結果顯示，連續給小鼠芹菜素灌胃14 d后，小鼠血清T濃度降低，并呈現一定的劑量反應關系，即隨芹菜素劑量的增加，小鼠血清T濃度降低(P＜0.05)。21 d低、中劑量組低于對照組(P＜0.05)。提示隨著芹菜素攝入量的增加，芹菜素對雄性小鼠睪酮的分泌具有明顯抑制作用。而高濃度的雄性激素環境是精子產生的必要條件，與睪酮降低相一致，小鼠a級精子百分率21 d各劑量組均低于同期陰性對照組(P＜0.01)。14 d各劑量組也低于同期陰性對照組，但差異無統計學意義。提示芹菜素對小鼠睪酮有明顯的降低作用，進一步影響小鼠精子的生成，特別是a級精子的生成，從而起到避孕的作用。并且從本次實驗推測，睪酮的降低到影響精子的生成需要近7 d的周期。結合本實驗的其他結果(精子運動參數)，推測芹菜素降低小鼠精子質量的作用主要是由于抑制了睪酮的生成。

Shivayogi P.等研究發現芹菜素對雌性大鼠有雌激素和抗雌激素樣作用［7］，本次實驗結果并未顯示芹菜素對雄性小鼠血清E2含量產生明顯的影響。

1 Noroozi M，Angerson WJ，Lean ME.Effects of flavonoids and vitamin C on oxidative DNA damage to human lymphocytes.Am J Clin Nutr，1998，67:1210-1218.

2 Prior RL，Cao G.Antioxidant capacity and polyphenolic components of teas:implications for altering in vivo antioxidant status.Proc Soc Exper Biol Med，1999，220:255-261.

3 Conney AH，Lu Y，Lou Y，et al.Inhibitory effect of green and black tea on tumor growth.Proc Soc Exper Biol Med，1999，220:229-233.

4 Gao JY(高金燕)，Chen HB(陳紅兵).Research progress of active constituent in celery.Food Nutri China(中國食品與營養)，2005，7:29-31.

5 WHO task force on methods for the regulation of male fertility.Contraceptive efficacy testosterone-induced azoospermia in normal men.Lancet，1990，336:955-959.

6 Zhang RD(張仁東).Research progress of homone contraceptive methods in normal men.Chin J Family Plan(中國計劃生育雜志)，2004，12:758-761.

7 Shivayogi P.Antifertility and hormonal properties of flavones of trigaoroban-chioide.Eur J Pharmacol，2000，391:193-197.