硝態(tài)氮在綿羊瘤胃中的代謝途徑初探

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 石彩霞 侯先志

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 孟慶翔＊周振明 任麗萍

Richardson 和 Watmought（1999）報(bào)道，硝態(tài)氮在厭氧環(huán)境下主要有三條代謝途徑，即同化作用、異化作用和反硝化作用。硝態(tài)氮同化還原和異化還原的中間產(chǎn)物均為亞硝酸鹽（），終產(chǎn)物均為銨（），但同化還原沒(méi)有的積累，NH4+也不會(huì)泌出細(xì)胞外。Lewis（1950）研究硝態(tài)氮在綿羊瘤胃內(nèi)的代謝，發(fā)現(xiàn)首先被還原為，再被還原為，最后合成微生物蛋白，并且的積累隨添加量的增加而增加，證明硝態(tài)氮在瘤胃內(nèi)遵循異化還原途徑，而非同化還原。一氧化二氮（N2O）和氮?dú)猓∟2）是硝態(tài)氮反硝化作用的重要中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物。Jones（1972）采用體外法研究硝態(tài)氮在瘤胃的代謝時(shí)檢測(cè)到有少量N2O產(chǎn)生。Kaspar和Tiedje（1981）也發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮在牛瘤胃代謝會(huì)產(chǎn)生N2O和N2。因此，硝態(tài)氮在瘤胃內(nèi)也可能存在反硝化還原途徑。動(dòng)物適應(yīng)硝態(tài)氮后不發(fā)生亞硝酸鹽中毒，是否是由于硝態(tài)氮在瘤胃內(nèi)的代謝途徑發(fā)生變化，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，研究其適應(yīng)硝態(tài)氮前后，硝態(tài)氮在瘤胃內(nèi)的代謝途徑，以揭示“適應(yīng)”對(duì)硝態(tài)氮在瘤胃代謝規(guī)律的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液供體動(dòng)物的飼養(yǎng)及日糧 6只安裝有永久性瘤胃瘺管的健康內(nèi)蒙古半細(xì)毛綿羊?yàn)榱鑫敢旱墓w動(dòng)物，隨機(jī)分為2組，每組3只。對(duì)照組綿羊以1%的尿素和豆粕為主要氮源。試驗(yàn)組綿羊用硝酸鉀（KNO3）逐漸替代尿素，第1周KNO3的飼喂量為0.75%，以后每周上升0.38%，直到喂量達(dá)到日糧干物質(zhì)的2.27%，此時(shí)硝態(tài)氮完全取代尿素氮，待動(dòng)物適應(yīng)硝酸鉀1周后，作為瘤胃液的供體動(dòng)物。

綿羊單籠飼養(yǎng)，每天 7∶00和 19∶00飼喂，自由飲水。日糧精粗比為30∶70，精料為混合精料，粗料為羊草。基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 體外產(chǎn)氣量試驗(yàn) 體外試驗(yàn)參照Menke（1979）的產(chǎn)氣量法。發(fā)酵底物以硝酸鉀為唯一氮源，可溶性淀粉和纖維素為碳源，它們?cè)诎l(fā)酵底物中分別占14.4%、35.6%和50%，配制成粗蛋白質(zhì)含量為12.5%的純合日糧，此時(shí)硝態(tài)氮在發(fā)酵底物中的含量為2%。于晨飼前分別采集對(duì)照組和試驗(yàn)組綿羊的瘤胃內(nèi)容物，用四層紗布過(guò)濾，過(guò)濾后的瘤胃液經(jīng)CO2飽和，并將其與39℃預(yù)熱的緩沖液配制成1∶2的混合培養(yǎng)液。將0.2000 g（干物質(zhì)基礎(chǔ)）發(fā)酵底物先稱好放入100 mL人工瘤胃培養(yǎng)管（德國(guó) H?berle公司，HFT000025，有效體積100 mL，最小分度1 mL）并39℃預(yù)熱，將30 mL混合培養(yǎng)液用自動(dòng)加樣器加入培養(yǎng)管中，放入水浴搖床39℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，并設(shè)3個(gè)空白對(duì)照（Lin 等，2011）。

1.3 樣品的采集 于體外培養(yǎng) 0、2、4、6、8、12 h和24 h分別采集樣品，測(cè)定-N-N、氨態(tài)氮（NH3-N）和微生物氮（MN）的產(chǎn)量；體外培養(yǎng)24 h時(shí)采集氣體樣品，分別測(cè)定N2O和氫氣（H2）、CH4、二氧化碳（CO2）和 N2的濃度。

1.4 樣品的測(cè)定 采集的培養(yǎng)液于5400 r/min離心10 min，在1.5 mL離心管內(nèi)準(zhǔn)確加入1 mL上清液和0.2 mL含有內(nèi)標(biāo)物2 EB的25%（m/V）偏磷酸溶液，混勻，冰水浴中放置30 min，然后于12000 g離心10 min，取上清液用超濾膜過(guò)濾，然后采用戴安ICS-2500離子色譜測(cè)定-N和-N 的濃度（林淼等，2010）。

NH3-N濃度的測(cè)定參照Broderich和Kang（1980）的比色法，用尤尼柯2100-分光光度計(jì)測(cè)定。

由于本試驗(yàn)發(fā)酵底物的氮源只有硝態(tài)氮，沒(méi)有其他蛋白氮，因此采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定MN的含量（Cone 等，1997）。

N2O的測(cè)定參照鄒建文等（2002）的方法，用Agilent 4890D氣相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用1 m×2.2 mm（內(nèi)徑）不銹鋼柱，內(nèi)填80～100目 Proapack Q，載氣為高純N2，柱溫為55℃，檢測(cè)器為ECD，330℃，流速 30 mL/min。

H2、CH4、CO2和 N2的測(cè)定采用北京分析儀器公司的TP-2060T氣相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采樣TDX-01填充柱，1 m×3 mm×2 mm；檢測(cè)器為 TCD，150℃；進(jìn)樣口溫度150℃，柱溫120℃，載氣為氦氣，流速 50 mL/min，進(jìn)樣量 0.1 mL（郭望山，2010）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后，采用SAS 9.0軟件單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)GLM過(guò)程進(jìn)行方差分析，瘤胃微生物來(lái)源以Tukey檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.1表示有趨勢(shì)。

2 結(jié)果

0 （P=0.006）、2 （P=0.004）、4 h （P ＜0.0001）和 6 h（P=0.0004），試驗(yàn)組的 NH3-N 濃度顯著高于對(duì)照組，8 h二者差異不顯著 （P=0.284），12 h（P=0.0002）和 24 h（P ＜ 0.0001）試驗(yàn)組NH3-N濃度又顯著低于對(duì)照組。

表2 體外培養(yǎng)0～24 h-N、-N、NH3-N和MN濃度變化

表2 體外培養(yǎng)0～24 h-N、-N、NH3-N和MN濃度變化

項(xiàng)目 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 24 h 24 h占總氮比例/%NO3-N/（mg/L）110.64 67.08 51.58 38.94 24.27 2.58 0.27 0.2對(duì)照組試驗(yàn)組SEM P值110.36 25.05 0.39 0.13 0.00 0.00 0.00 0.09.72 3.53 2.31 0.75 0.80 0.74 0.07 0.0040.974 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001 0.013 0.009 0.009 NO2-N/（mg/L）0.00 0.00 0.00 2.15 5.19 0.34 0.00 0.0對(duì)照組試驗(yàn)組SEM P值0.00 0.00 0.96 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00.00 0.00 0.16 0.26 1.48 0.13 0.00 0.00--0.002 0.001 0.001 0.033 - -NH3-N/（mg/L）16.47 50.79 39.24 40.44 64.01 89.70 100.83 80.0對(duì)照組試驗(yàn)組SEM P值21.60 55.54 58.62 60.06 60.34 66.48 43.30 32.81.89 0.98 1.39 2.16 3.64 1.70 2.96 2.280.006 0.004 ＜0.0001 0.0004 0.284 0.0002 ＜0.0001 ＜0.0001 MN/（mg/L）0.00 1.99 40.23 53.19 26.35 24.57 18.90 15.0對(duì)照組試驗(yàn)組SEM P值0.00 44.90 58.96 60.73 60.96 61.86 68.96 52.20.00 5.06 3.53 5.39 3.34 2.38 3.03 2.33-0.001 0.003 0.999 0.011 0.002 ＜0.0001 ＜0.0001總和占日糧氮的比例/%100 94 103 106 94 92 95對(duì)照組試驗(yàn)組SEM P值100 95 96 92 92 93 850442322-0.288 0.365 0.003 0.140 0.243 0.002

除6 h （P=0.999） 外，2 （P=0.001）、4 （P=0.003）、8（P=0.011）、12 h（P=0.002）和 24 h（P ＜0.0001），試驗(yàn)組的MN濃度均顯著高于對(duì)照組。

對(duì) 照 組在 0、2、4、6、8、12 h 和 24 h，NO3--N、-N、NH3-N和MN的總和占發(fā)酵底物總氮的92% ～ 106%；在發(fā)酵 24 h時(shí)，、、NH3-N和 MN的濃度分別為 0.27、0、100.83 mg/L和18.90 mg/L，占發(fā)酵底物總氮的0.2%、0%、80%和15%。試驗(yàn)組在 0、2、4、6、8、12 h 和 24 h 時(shí)，-N、-N、NH3-N和MN的總和占發(fā)酵底物總氮的85% ～ 100%；在發(fā)酵24 h時(shí)，-N、-N、NH3-N和 MN的濃度分別為0、0、43.30 mg/L和68.96 mg/L，占發(fā)酵底物總氮的0%、0%、32.8%和52.2%。證明無(wú)論瘤胃微生物是否適應(yīng)硝態(tài)氮，它在瘤胃的代謝途徑均以下面途徑為主：

由表3可見(jiàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的總產(chǎn)氣量（P=0.146）及 H2（P=0.737）、CH4（P=0.552）和 CO2（P=0.532）產(chǎn)量差異均不顯著，但試驗(yàn)組N2產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組（P=0.042）。

表3 體外培養(yǎng)24 h氣體的產(chǎn)量mL/g DM

3 討論

在本試驗(yàn)中，NH3-N的濃度取決于-N的降解速度、-N的積累和MN的合成速度。雖然試驗(yàn)組的MN合成速度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但在培養(yǎng)的前8 h，試驗(yàn)組的-N降解速度極顯著快于對(duì)照組（P＜0.01），又沒(méi)有-N積累，因此在體外培養(yǎng)的前6 h，試驗(yàn)組的NH3-N濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。然而，對(duì)照組的N-N在培養(yǎng)8 h濃度達(dá)到最高，有些微生物可能出現(xiàn)亞硝酸鹽中毒，影響了MN的合成，導(dǎo)致發(fā)酵后期對(duì)照組的NH3-N濃度又顯著高于試驗(yàn)組（P ＜ 0.01）。

在體外培養(yǎng)過(guò)程中，除發(fā)酵6 h外，其他時(shí)間試驗(yàn)組的MN濃度都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），這與試驗(yàn)組瘤胃微生物適應(yīng)硝態(tài)氮相一致。

反硝化是硝態(tài)氮在厭氧環(huán)境中的一條重要代謝途徑，中間產(chǎn)物主要為N2O，終產(chǎn)物為N2。在本試驗(yàn)中體外培養(yǎng)24 h，沒(méi)有檢測(cè)到N2O，只檢測(cè)到少量的N2，并且試驗(yàn)組的N2產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組（P=0.042），但二者產(chǎn)量均不高。 Jones（1972）用體外法研究硝酸鹽代謝時(shí)發(fā)現(xiàn)，有少量的N2O產(chǎn)生，因此認(rèn)為瘤胃存在反硝化作用。Kaspar和Tiedje（1981）采用N13和N15標(biāo)記法研究硝酸鹽和亞硝酸鹽在牛瘤胃的還原過(guò)程，也檢測(cè)到有N2O和N2的產(chǎn)生，但研究認(rèn)為這兩種物質(zhì)不是硝酸鹽反硝化作用的產(chǎn)物，因?yàn)樵囼?yàn)使用了乙炔氣體在N2O水平上抑制反硝化作用，即用乙炔抑制N2O還原為N2，使來(lái)自反硝化作用的N2O產(chǎn)量不變或增加。然而 Kaspar和 Tiedje（1981）研究發(fā)現(xiàn)，將乙炔從5%增加到50%，并沒(méi)有增加N2O的產(chǎn)量，因此他認(rèn)為N2O不是來(lái)自于瘤胃內(nèi)硝酸鹽的反硝化作用，但他無(wú)法解釋為什么有N2產(chǎn)生。

試驗(yàn)中雖然沒(méi)有檢測(cè)到N2O，但檢測(cè)到了N2，它是反硝化途徑的終產(chǎn)物。因此本研究認(rèn)為，瘤胃可能存在一定的反硝化作用，因?yàn)橥寥篮椭参镏写嬖诖罅康姆聪趸?xì)菌，它們很有可能隨飼料進(jìn)入瘤胃，使瘤胃發(fā)生反硝化作用（Paul，2007）。試驗(yàn)組的N2產(chǎn)量顯著高于對(duì)照組，可能是瘤胃微生物在適應(yīng)硝態(tài)氮的過(guò)程中，促進(jìn)了反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)，使試驗(yàn)組的N2產(chǎn)量增加，這也有利于抑制瘤胃N的產(chǎn)生。但在本試驗(yàn)中N2的產(chǎn)量非常少，即使瘤胃內(nèi)硝態(tài)氮存在反硝化作用，它也不是其主要的代謝途徑。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論瘤胃微生物適應(yīng)硝態(tài)氮與否，硝態(tài)氮在瘤胃的還原途徑均以異化還原為主，同時(shí)，可能存在一定的反硝化作用。

[1]郭望山.飼料硝態(tài)氮對(duì)CP測(cè)定的影響及瘤胃微生物區(qū)系、發(fā)酵特性和閹公羊生產(chǎn)性能對(duì)添加硝態(tài)氮的反應(yīng)：[博士學(xué)位論文][D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[2]林 淼，郭望山，孟慶翔，等.瘤胃微生物不同區(qū)系的硝態(tài)氮還原、甲烷產(chǎn)生和發(fā)酵參數(shù)比較[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（19）：4088 ～ 4093.

[3]鄒建文，焦燕，王躍思，等.稻田 CO2、CH4和 N2O 排放通量測(cè)定方法研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（4）：45 ～ 48.

[4]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem，1976，72：248 ～ 254.

[5]Broderick G A，Kang J H.Automated simultaneous determination of ammonia and amino acids in ruminal fluids and in vitro media[J].J Dairy Sci，1980，63：64 ～ 75.

[6]Cheng K L，Phillippe R C，Costerton J W，et al.Induction of Nitrate and Nitrite Metabolism in Bovine Rumen Fluid and the Transfer of this Capacity to Untreated Animals[J].Can J An Sci，1985，65：647 ～ 652.

[7]Cone J W.Description of gas production profiles with a three-phasic model[J].J Sci Technol， 1997，66：31 ～ 45.

[8]Guo W S，Schaefer D M，Meng Q X，et al.Use of nitrate-nitrogen as a sole dietary nitrogen source to inhibit ruminal methanogenesis and to improve microbial nitrogen synthesis in vitro[J].Asian-Aust J Anim Sci，2009，22：542 ～ 549.

[9]Jones G A.Dissimilatory metabolism of nitrate by the rumen microbiota[J].Can J Microbiol，1972，18：1783 ～ 1789.

[10]Kaspar H F，Tiedje J M.Dissimilatory reduction of nitrate and nitrite in the bovine rumen：nitrous oxide production and effect of acetylene[J].Appl Environ Microbiol，1981，41：705 ～ 709.

[11]Lewis D.The metabolism of nitrate and nitrite in the sheep[J].Biochem J，1950，48：175 ～ 180.

[12]Lin M，Schaefer D M，Meng Q X，et al.Comparisons of in vitro nitrate reduction，methanogenesis，and fermentation acid profile among rumen bacterial，protozoal and fungal fractions[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2011，24：471 ～ 478.

[13]Marais J P，Therion J J，Dennison C，et al.Effect of nitrate and its reduction products on the growth and activity of the rumen microbial population[J].Br J Nutri，1988，59：301 ～ 313.

[14]Menke K H，Raab H，Schneider W，et al.The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J].J Agric Sci（Camb），1979，93：217 ～ 222.

[15]Paul E A.Soil Microbiology，Ecology，and Biochemistry[M].Burlington:Academic Press Elsevier Inc，2007.3 ～ 21.

[16]Richardson D J，Watmough N J.Inorganic nitrogen metabolism in bacteria[J].Curr Opin Chem Biol，1999，3：207 ～ 219.