人臍帶間充質干細胞向Raji細胞遷移并促進其增殖的研究

賴 菁, 劉革修, 祝愛珍, 陳盛亭△

(暨南大學 1第一臨床醫學院， 2醫學院血液病研究所， 廣東 廣州 510632)

人臍帶間充質干細胞向Raji細胞遷移并促進其增殖的研究

賴 菁1, 劉革修2, 祝愛珍1, 陳盛亭1△

(暨南大學1第一臨床醫學院，2醫學院血液病研究所， 廣東 廣州 510632)

目的體外研究人Burkitt淋巴瘤細胞系Raji細胞和人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSC)間的相互作用，探討MSC在惡性腫瘤治療中的潛在應用前景。方法將Raji細胞和hUC-MSC進行直接接觸和非接觸共培養，觀察MSC對Raji細胞的作用，采用CCK-8法觀察Raji細胞的增殖情況，流式細胞術檢測Raji細胞周期的變化，同時應用siRNA干擾技術分析血管內皮生長因子(VEGF)在MSC向Raji細胞遷移過程中的作用(即用siRNA阻斷Raji細胞VEGF的表達)，ELISA法檢測Raji細胞培養上清VEGF的分泌量，qRT-PCR法檢測Raji細胞VEGF mRNA表達的變化。結果MSC及其條件培養基(MSC-conditioned medium,MSC-CM)均促進Raji細胞的增殖，72 h MSC-CM培養的Raji細胞增殖活性為0.99±0.05，而對照組為0.71±0.07(P<0.01)。無論是直接接觸還是條件培養基均促使Raji細胞從G0/G1期向S期的轉化，MSC-CM的作用尤其明顯，S期的細胞數目由16.33±1.37增加到28.50±1.41，而G0/G1期細胞數目則由77.70±1.57下降到54.40±1.57(P<0.01)。siRNA干擾Raji細胞后，VEGF無論是在蛋白水平還是mRNA水平都明顯下降，且MSC向Raji細胞的趨化能力也顯著降低(96.00±5.28vs143.00±7.20,P<0.01)。結論MSC具有向Raji細胞趨化的作用，其機制與Raji細胞分泌VEGF呈正相關；MSC可促進Raji細胞從G0/G1期向S期轉化，從而促進Raji細胞的增殖。

人臍帶間充質干細胞； Raji細胞； 血管內皮生長因子

近年來關于間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)與腫瘤的關系已有不少研究,但仍頗俱爭論。一方面，Khakoo等[1]的實驗證實，MSC可通過抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，Akt)活性，直接接觸抑制卡波西肉瘤細胞的生長而不依賴宿主自身的免疫系統；MSC亦可通過下調抗凋亡因子Bcl-2，并誘導產生凋亡因子caspase-3，促進腫瘤細胞凋亡[2-3]。另一方面，有報道MSC可通過整合素依賴機制與腫瘤細胞直接接觸增強腫瘤細胞抗凋亡的能力和耐藥性[4-5]；也可分泌一系列可溶性細胞因子，如白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、趨化因子配體5(chemokine ligand 5， CCL5)等促進腫瘤的生長和轉移[6-7]；還可以通過免疫逃逸，參與構建腫瘤基質等方式促進腫瘤的發生發展[8-11]。由于MSC表達一系列的趨化因子受體和黏附分子，如CXCR4、CCR7、E選擇蛋白等，使其具有向缺血、炎癥病灶及腫瘤定向遷移的能力[12-13]，目前也有較多基于MSC的腫瘤趨向性而將其作為基因載體靶向腫瘤細胞的基因治療研究[14-16]。

淋巴瘤是一類血液系統的惡性腫瘤，其與實體腫瘤既有相似之處，又有其特殊的病理生理特點。目前臨床上大部分淋巴瘤屬于非霍奇金淋巴瘤，近幾年發病率有增加的趨勢。而侵襲性和惰性淋巴瘤病人的存活率仍然較低[17]。因此如何加強淋巴瘤尤其是侵襲性非霍奇金淋巴瘤的治療仍是目前亟待解決的問題。MSC與淋巴瘤細胞的關系目前尚少有報道。本實驗中我們以人Burkitt淋巴瘤細胞系Raji細胞和人臍帶MSC(human umbilical cord MSC,hUC-MSC)為研究對象，探索淋巴瘤細胞與MSC的關系。

材 料 和 方 法

1細胞株及主要試劑

臍帶由暨南大學第一附屬醫院婦產科提供，均征得產婦及家屬的同意。Raji細胞為暨南大學血液病研究所原凍存種子。膠原酶IV、DMEM/F12、RPMI-1640培養基和胎牛血清購自Gibco;CCK-8檢測試劑盒購自Dojindo;周期試劑盒由暨南大學檢測中心提供;Lipofectamine 2000(Lip-2000)和引物合成均為Invitrogen產品;ELISA試劑盒購自R&D；Transwell小室購自Corning;Giemsa染料購自南京建成生物科技公司；結晶紫染料購自上海碧云天生物科技研究所。

2方法

2.1hUC-MSC的分離和培養 無菌取正常足月產健康嬰兒的臍帶，PBS洗凈殘留血液，剝離臍靜脈、臍動脈，保留Wharton膠，并剪至約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，用含0.2%膠原酶IV、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的培養基于37 ℃恒溫振蕩消化4 h。消化后用10倍體積的PBS稀釋并過濾，所得濾液離心后用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基重懸，以1×106cells/cm2密度接種于T25培養瓶中，3 d后全量換液，待細胞90%融合后0.25%胰酶消化，按1∶2或1∶3的比例傳代，P 3細胞進行流式細胞表面標志及成骨成脂誘導分化鑒定[18]。本實驗所用臍帶MSC均為3～7代。

2.2Raji細胞的培養 人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基于37 ℃、5%CO2孵箱中培養，每2 d換液傳代。所有實驗均使用處于對數生長期的Raji細胞，實驗組中有MSC條件培養基(conditioned medium，CM)，為單層鋪滿MSC更換新鮮培養基正常培養12 h后0.22 μm過濾所得，對照組Raji細胞也使用DMEM/F12培養基培養。

2.3CCK-8檢測MSC對Raji細胞增殖的影響 將Raji以1×104cells/well接種至96孔板，每孔體積200 μL,實驗組為與MSC直接培養(MSC∶Raji=1∶10,MSC經絲裂霉素15 mg/L作用3h使其停滯生長)及與其CM培養，同時設無細胞的空白對照組調零，每組5個復孔。為了保證細胞有充足的營養，每24 h換液。分別在24、48、72、96 h加入CCK-8，孵育4 h后全自動酶標儀上檢測各孔的吸光度值(測量波長480 nm，參考波長630 nm)。

2.4MSC對Raji細胞周期的影響 Raji細胞分3組：常規培養對照組(normal culture group)、與MSC直接共培養組(direct coculture group)和MSC條件培養基組(conditioned medium group)。以每孔5×105個細胞接種至6孔板，培養48 h后，收集各組細胞，PBS洗2遍，預冷70%乙醇4 ℃固定過夜，PBS洗2遍，離心棄PBS，加入500 μL PI 染液(碘化丙啶及RNase A 終濃度均為50 mg/L)，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測進行細胞周期分析。

2.5siRNA干擾技術分析血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在MSC向Raji細胞遷移中的作用

2.5.1siRNA的轉染 VEGF特異siRNA序列參考文獻[19]，為AUG UGA AUG CAG ACC AAA GAA dTdT和UUC UUU GGU CUG CAU UCA CAU dTdT，由Invitrogen公司合成。將siRNA與Lip-2000用無血清無抗生素1640培養基稀釋混合后室溫靜置20 min，加入接種了Raji細胞的6孔板中, 37 ℃培養6 h，更換新鮮不含抗生素的培養液繼續培養至24 h。

2.5.2細胞分4組 VEGF-siRNA處理組(VEGF-siRNA group，Lip-2000 + VEGF siRNA)、陰性錯配對照組 (negative group, Lip-2000 + 錯配的siRNA)、脂質體對照組 (Lip group，含Lip-2000 + 常規培養的Raji細胞)和正常對照組 (normal group，常規培養的Raji細胞)。

2.6ELISA法檢測Raji細胞培養上清VEGF 采用R&D 公司Quantikine Human VEGF ELISA 試劑盒檢測。24 h后將以上各組Raji細胞以1 200 r/min 離心5 min收集細胞上清液, 置-80 ℃保存待測。測量前將上清液室溫解凍，按照VEGF ELISA 試劑盒操作要求依次加樣、孵育、洗滌、酶標儀450 nm 測各組A值，計算VEGF的濃度(ng/L)。

2.7qRT-PCR法檢測Raji細胞VEGF mRNA的表達

2.7.1RNA的提取 取上述各組Raji細胞與MSC間接共培養(采用孔徑0.4 μm Transwell小室，MSC接種至下室，Raji細胞接種至上室)24 h后，根據RNAiso Plus說明書提取RNA。

2.7.2cDNA合成 根據天根試劑盒說明書，取1～5 μL所提取的總RNA，將其逆轉錄成cDNA。

2.7.3qRT-PCR 取1 μL稀釋10倍的逆轉錄產物為模板，參照天根Quant SYBR Green PCR 試劑盒進行熒光定量PCR，反應體系20 μL。引物序列參照文獻[19]，VEGF引物序列反義鏈5’-CCCTGCCCCCTTCAATATTC-3’，正義鏈5’-AGGAAAGTGAGGTTACGTGCG-3’；GAPDH引物序列反義鏈5’-TTCACCACCATGGAGAAGGCT-3’, 正義鏈5’-ATGGCATGGACTGTGGTCATG-3’。反應條件95 ℃ 2 min;95 ℃15 s; 56 ℃ 15 s; 72 ℃ 30 s。每個樣本設3個平行反應，同時擴增 GAPDH為內參照,以 2-ΔΔCt方法計算 VEGF mRNA的相對表達量。

2.8Transwell體外遷移趨化實驗 MSC無血清饑餓處理24 h，24孔Transwell小室預先用單純培養基平衡過夜。上室加入饑餓處理后的1×109/L MSC 無血清懸液100 μL，為了避免血清的干擾，下室Raji細胞均用無血清的培養基重懸。下室分3組：正常Raji組(Raji group)、Raji+siRNA組(Raji-siRNA group)和單純培養基組(medium group)，總體積600 μL，Raji細胞數均為1×105個，每組3個復孔。常規培養24 h后，PBS將小室洗2遍，用棉棒輕輕擦去小室內側未遷移的細胞，90%乙醇固定30 min， 風干，結晶紫染色15 min后將小室底面朝上，分別取上、下、左、右、中5個視野于正置顯微鏡下拍照并計數，取其平均值比較各組間遷移至膜背面的細胞數量差別。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示, SPSS 13.0分析數據，多組間采用單因素方差(ANOVA)分析, 組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD法),時間趨勢采用重復測量設計的方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1hUC-MSC細胞的培養及形態特點

原代接種后24 h即可見少量細胞貼壁，呈紡錘形或多角形，細胞生長緩慢，10 d后當細胞亞融合時生長速度顯著增快。傳代至第3代的hUC-MSC呈長梭形，細胞體積較大，胞質豐富，細胞核及核仁明顯，流式細胞術檢測其高表達CD44和CD29，不表達造血干細胞標志CD34和CD45，不表達HLA-DR和CD106；經成骨成脂分化誘導，可分化為成骨細胞和脂肪細胞。

Figure 1. Giemsa staining of hUC-MSC (passage 3).

圖1第3代hUC-MSC的Giemsa染色

2MSC對Raji細胞生長的促進作用

CCK-8結果顯示，隨著時間的增加，與MSC直接接觸培養及與MSC-CM培養的Raji細胞增殖比對照培養的Raji細胞明顯較快。隨著培養時間的增加，促Raji細胞增殖作用增加，三者隨時間變化的趨勢有統計學意義(P<0.05)。與MSC-CM培養72 h尤其明顯，細胞增殖活性A值為0.99±0.05，而對照組為0.71±0.07，兩者差異顯著(P<0.01),見圖2。

Figure 2. MSC promote the growth of Raji cells.Mean±SD.n=5.**P<0.01vsRaji cells.

圖2MSC促進Raji細胞的生長

3MSC對Raji細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果顯示，培養48 h后，無論是與MSC直接接觸培養還是通過MSC-CM培養的Raji細胞，其S期的比例都明顯增高(P<0.05)，而G0/G1期細胞比例減少(P<0.05),見圖3、表1。

Figure 3. Effect of MSC on the cell cycle of Raji cells detected by flow cytometry.

圖3MSC對Raji細胞細胞周期的影響

表1MSC對Raji細胞細胞周期的影響

Table 1. Effect of MSC on the cell cycle of Raji cells (mean±SD.n=3)

GroupG0/G1(%)S(%)G2/M(%)Normalculture77.70±1.5716.33±1.375.97±1.33Directcoculture68.40±1.58*19.47±1.38*12.80±1.29*Conditionedmedium54.40±1.57*28.50±1.41*17.10±1.26*

*P<0.05vsnormal culture group.

4ELISA法檢測Raji細胞培養上清VEGF

各組培養24 h時上清的VEGF結果見表2。正常對照組Raji細胞上清VEGF含量為(306.82±53.12)ng/L，脂質體對照組及陰性錯配組與其相比無顯著差異(P>0.05),因此實驗結果可排除脂質體毒性和siRNA的非特異性干擾作用。VEGF -siRNA 轉染的Raji細胞組VEGF顯著下降至(176.42±29.26)ng/L，差異有統計學意義(P<0.01)。

表2上清VEGF含量

Table 2. The concentration of VEGF in the supernatant(ng/L.Mean±SD.n=3)

GroupVEGFlevelNormal306.82±53.12Lip278.53±42.98Negative280.68±43.47VEGF-siRNA176.42±29.26**

**P<0.01vsnormal group.

5VEGF-siRNA轉染后Raji細胞VEGFmRNA表達下調

qRT-PCR的結果顯示，VEGF-siRNA 轉染后Raji細胞VEGF mRNA表達顯著下調，正常對照組Raji細胞VEGF表達水平為7.39±1.32，明顯高于VEGF -siRNA處理組的2.11±1.07，差異顯著(P<0.05),見表3。

表3 Raji細胞VEGF mRNA的表達水平

*P<0.05vsnormal group.

6VEGF-siRNA轉染Raji細胞后對MSC的趨化作用減弱

Transwell細胞培養體系趨化檢測結果顯示，與單純培養基組的25.00±4.33相比，正常Raji細胞組MSC的遷移細胞數則顯著增多，為143.00±7.20(P<0.01)，說明Raji細胞有趨化MSC的能力。而VEGF-siRNA 轉染Raji細胞后對MSC的趨化作用則減弱，遷移細胞數為96.00±5.28，與正常Raji細胞組相比差異顯著(P<0.05),見圖4,說明VEGF參與了Raji細胞對MSC的趨化作用。

Figure 4. Migration of MSC towards Raji cells in Transwell chambers. A: Raji group; B: medium group; C: Raji-siRNA group.

圖4MSC向Raji細胞的遷移

討 論

有關MSC與惡性腫瘤包括血液系統惡性腫瘤的關系各家報道不一。一些學者認為MSC能夠抑制血液惡性腫瘤細胞的生長，Fonseka等[20]研究發現hUC-MSC可通過劑量依賴的方式將K562細胞阻滯在G0/G1期，抑制其生長，且這種抑制作用可能與hUCB-MSC增加IL-6、IL-8、TGF-β1等細胞因子有關。Secchiero等[21]將BM-MSC腹腔內注射入已建立的2個彌漫性淋巴瘤的裸鼠模型體內，發現其顯著增加了小鼠的生存率。與之相反，Amé-Thomas等[22]研究報道，來源于骨髓和淋巴器官的人MSC支持B細胞腫瘤細胞的生長。Lwin等[23]報道，骨髓基質細胞可通過上調非霍奇金淋巴瘤細胞NF-κB (RelB/p52)活化相關的抗凋亡蛋白來抑制淋巴瘤細胞的凋亡。

本實驗以HUC-MSC和Raji細胞為對象，體外研究顯示MSC可通過促進處于G0/G1期Raji細胞向S期的轉化，進而促進Raji細胞生長。本實驗中，無論是直接接觸還是MSC的條件培養基均能增加Raji細胞S期的比例及其增殖活性。這與Malini等的研究結果相反。是否不同來源的MSC及不同腫瘤細胞株造成研究結果的差異，尚待在相同實驗條件下用相同實驗方法做進一步研究觀察。另外，本研究還顯示Raji細胞高表達VEGF則MSC向其趨化增強，而抑制VEGF表達則MSC向Raji細胞的趨化顯著降低，表明VEGF是促進MSC向Raji細胞趨化的因素之一。VEGF是血管新生正性調控因子，它不僅在許多實體惡性腫瘤中高表達[24],在多種惡性血液病中也高表達[25]。VEGF可促進惡性血液系統腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，并增強其抗凋亡能力[26]。

總之，本研究結果顯示，在體外Raji細胞具有趨化MSC作用，且MSC可通過促進Raji細胞G0/G1期向S期的轉化來促進Raji細胞增殖。在體內Raji細胞與MSC的關系如何，MSC是否依然有向Raji細胞遷移并促進其增殖的作用，MSC對淋巴瘤的潛在臨床應用前景如何，這些問題有賴于建立有效的動物模型在體內做進一步的實驗觀察。

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HumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsmigratetoRajicellsandpromotetheirproliferation

LAI Jing1, LIU Ge-xiu2, ZHU Ai-zhen1, CHEN Sheng-ting1

(1TheFirstClinicalCollege,2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:chenshengting@tom.com)

AIM: To investigate the interaction between human Burkitt lymphoma cell line Raji and human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSC).METHODSThe direct and indirect effects of MSC on Raji cells were investigated. The viability of Raji cells was tested by CCK-8 assay, and the cell cycle was determined by flow cytometry. The importance of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the migration of MSC to Raji cells was analyzed by blocking VEGF expression in Raji cells with small interfering RNA (siRNA). VEGF level in the supernatant was detected by ELISA, and the mRNA expression of VEGF was measured by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).RESULTSBoth MSC and MSC-conditioned medium (MSC-CM) promoted the growth of Raji cells. The viability of Raji cells co-cultured with MSC-CM was 0.99±0.05 at 72 h, and that in control group was 0.71±0.07. Both direct co-culture with MSC and MSC-CM turned the Raji cells from G0/G1phase to S phase. The number of Raji cells co-cultured with MSC-CM in S phase was increased from 16.33±1.37 to 28.50±1.41, and the number in G0/G1phase was decreased from 77.70±1.57 to 54.40±1.57. The expression of VEGF was down-regulated either at mRNA or protein level after transfection with siRNA. The ability of MSC migrated to Raji cells was significantly declined (96.00±5.28vs143.00±7.20).CONCLUSIONRaji cells recruit MSC by secreting VEGF, and MSC promote the proliferation of Raji cells by turning the cells from G0/G1phase to S phase.

Human umbilical cord mesenchymal stem cells; Raji cells; Vascular endothelial growth factors

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.015

1000- 4718(2013)01- 0093- 06

2012- 08- 23

2012- 10- 25

△通訊作者Tel: 020- 38688439; E-mail: chenshengting@tom.com