槲皮素對人卵巢癌SKOV-3細胞增殖的影響*

鄧曉慧, 宋海巖, 孫春莉

(新鄉醫學院人體解剖學教研室，河南 新鄉 453003)

槲皮素對人卵巢癌SKOV-3細胞增殖的影響*

鄧曉慧△, 宋海巖, 孫春莉

(新鄉醫學院人體解剖學教研室，河南 新鄉 453003)

目的探討槲皮素對人卵巢癌SKOV-3細胞增殖抑制和凋亡的影響，為卵巢癌臨床治療提供依據。方法不同濃度槲皮素處理卵巢癌SKOV-3細胞后，采用MTT實驗檢測細胞增殖抑制作用并計算抑制率，細胞免疫化學染色法鑒定細胞凋亡，流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡。結果槲皮素能夠抑制SKOV-3細胞的增殖，且呈時間和劑量依賴性，免疫熒光顯示槲皮素對SKOV-3細胞具有誘導凋亡作用，流式細胞術顯示SKOV-3細胞被阻滯在S期， G2/M期細胞比例降低，凋亡率上升。結論槲皮素在體外能夠抑制卵巢癌SKOV-3細胞的增殖，阻止細胞由S期向G2期移行，促進其凋亡。

細胞凋亡； 卵巢腫瘤； 槲皮素

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而位居第3位，但因卵巢癌死亡率占各類婦科腫瘤的首位[1]，對婦女生命造成嚴重威脅。目前治療卵巢癌的化療藥物不僅對腫瘤細胞具有殺傷力，對正常細胞的副作用也非常大，故尋找有效的化療藥物是當務之急。槲皮素(quercetin,Que)是黃酮類化合物的一種，在自然界廣泛存在于水果、蔬菜以及植物中[2-3]。近年來槲皮素在抑制腫瘤細胞生長及防止惡性轉移方面的研究表明槲皮素有望應用到臨床抗腫瘤的治療，它可以通過誘導腫瘤細胞凋亡或者是通過阻止細胞周期中某個環節來抑制癌細胞增殖[4-6]。我們前期實驗發現槲皮素對胃癌、食管癌有抑制增殖作用，但是槲皮素對卵巢癌這方面的效果需進一步探討，本文通過體外抗瘤實驗為藥物應用提供依據。

材 料 和 方 法

1材料

人卵巢癌SKOV-3細胞購于中國醫學科學院腫瘤細胞庫。Que購于Sigma,用二甲基亞砜(DMSO)溶解后-20 ℃保存，實驗時用RPMI-1640培養基稀釋。MTT和DMSO 購于Sigma，Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)購于Invitrogen，胎牛血清購于武漢博士德生物工程有限公司，細胞周期及細胞凋亡試劑盒、細胞凋亡-Hoechst試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

2方法

2.1細胞培養 卵巢癌SKOV-3細胞培養于含10% 胎牛血清的DMEM培養基中，同時加入1%青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度孵育箱中培養。

2.2細胞抑制率檢測 采用MTT法檢測細胞活性并計算細胞抑制率，將對數生長期的SKOV-3細胞置于96孔板中(5×103cells/well)，培養24 h后換液，同時在培養基中加入濃度不同的槲皮素(0、0.12、0.23、0.47、0.94、1.88、3.725、7.5、15、30 g/L)，每個濃度設3個孔，繼續培養24 h、48 h后，加入MTT(5 g/L)各20 μL，4 h后，吸出培養液每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標儀570 nm波長下測吸光度(A)。

2.3細胞凋亡率檢測 用Annexin V-FITC/PI雙染色法分析槲皮素誘導SKOV-3細胞凋亡作用，分別收集0、15、30 g/L槲皮素作用24 h后的貼壁細胞于10 mL離心管中，調制成單細胞懸液濃度為1×109cells/L,1 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液，PBS洗滌離心后，把細胞重懸于200 μL孵育緩沖液加入10 μL Annexin V-FITC/PI避光室溫反應15 min，加入孵育緩沖液300 μL，用流式細胞儀檢測。

2.4免疫熒光凋亡鑒定 按照Hoechst試劑盒操作步驟，將細胞置于6孔板培養24 h，加入槲皮素培養48 h，取出6孔板中的蓋玻片，PBS洗滌后加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS洗滌2遍各 3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，于搖床上染色5 min后PBS 洗滌2遍，每次3 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下檢測細胞核,計算細胞凋亡率，細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

2.5細胞周期檢測 取對數生長期細胞接種在12孔板中培養24 h，分別加入槲皮素(濃度為30 g/L)和培養基，培養48 h后用胰酶消化離心，PBS洗滌制成單細胞懸液，冰乙醇4 ℃固定過夜，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色1 h后流式細胞儀檢測。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0進行統計學分析，各組間差異用單因素方差分析(ANOVA)比較，兩組比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1槲皮素對SKOV-3細胞增殖抑制作用

卵巢癌SKOV-3細胞在含有不同濃度(0.12～30 g/L)槲皮素培養基中分別培養24 h和48 h后， MTT結果顯示,細胞的生長活性明顯降低，增殖受到抑制，相同藥物劑量隨培養時間延長細胞活性相應降低，槲皮素30 g/L培養48 h后細胞活性最低，增殖抑制率最高達58.72%，抑制率呈現劑量、時間依賴性，見圖1。

Figure 1. Effect of quercetin on the viability of SKOV-3 cells at 24 h and 48 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 g/L;△P<0.05vs24 h.

圖1槲皮素作用24h和48h對SKOV-3細胞活性的影響

2流式細胞術檢測細胞凋亡

用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測槲皮素誘導SKOV-3細胞凋亡作用，正常細胞分布于分析圖左下區，早期凋亡細胞分布于右下區，右上區為晚期凋亡細胞或死亡細胞，早、晚期凋亡率的和為總凋亡率。結果顯示，15 g/L組的總凋亡率為(33.62±1.17)%,明顯高于對照組[(7.13±0.92)%](P<0.01)，30 g/L組的總凋亡率為(69.12±2.97)%，與低劑量組和對照組均有顯著差異(P<0.01)，見圖2。

3細胞凋亡形態學結果

15 g/L組和30 g/L組與對照組相比凋亡數明顯增多，凋亡率均高于正常對照組，差異顯著(P<0.05),見圖3。

4細胞周期結果

SKOV-3細胞用槲皮素作用48 h后，用流式細胞術對細胞周期進行分析，結果顯示卵巢癌SKOV-3細胞被槲皮素處理后，細胞分裂周期中S期細胞比率明顯增加， G2期細胞顯著降低，減少至零,見圖4，提示槲皮素主要使細胞大多停留在S期，導致凋亡。

討 論

生物類黃酮由于其獨特的生物特性, 近年來人們大量地從蔬菜水果中提取黃酮類化合物，據報道黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌、預防癌癥等作用[7-8]。近年來由于卵巢癌的高發病率以及高死亡率，迫切需要尋找一種有效的臨床治療方法。槲皮素為黃酮類的一種，研究發現它能夠抑制結腸癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌以及乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[9-11]，本實驗進一步探討槲皮素對卵巢癌細胞的影響，旨在為槲皮素應用于卵巢癌的臨床治療提供實驗依據。

Figure 2. Detection of apoptosis of SKOV-3 cells by flow cytometry.Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 g/L;△△P<0.01vs15 g/L.

圖2流式細胞術檢測槲皮素對SKOV-3細胞凋亡的影響

Figure 3. The results of Hoechst 33258 staining(×100).Mean±SD.n=6.▲P<0.05vs0 g/L.

圖3各組細胞凋亡Hoechst33258染色結果

Figure 4. Effect of quercetin (0 g/L and 30 g/L) on the cell cycle of SKOV-3 cells.Mean±SD.*P<0.05，**P<0.01vs0 g/L.

圖4槲皮素對SKOV-3細胞細胞周期的影響

本實驗通過MTT檢測不同劑量、不同作用時間的槲皮素對卵巢癌SKOV-3細胞生長活性的影響，結果顯示槲皮素對卵巢癌細胞的生長活性具有抑制作用，其增殖抑制率與作用時間和劑量呈明顯的相關性，隨藥物濃度增大，作用時間的延長，抑制率明顯升高。流式細胞術分析細胞凋亡，SKOV-3細胞經過Annexin V-FITC/PI雙染色，結果顯示槲皮素對卵巢癌細胞有誘導凋亡作用，細胞凋亡率與劑量呈正相關性。Hoechst染色法在形態學上同時也驗證了槲皮素能夠誘導卵巢癌SKOV-3細胞凋亡。以上結果表明槲皮素能夠抑制卵巢癌細胞增殖并誘導其凋亡。

凋亡在細胞壞死過程中起重要作用，在調控腫瘤細胞的增殖、腫瘤的形成和發展中起關鍵作用。本實驗通過流式細胞術分析槲皮素抑制卵巢癌SKOV-3細胞增殖的可能機制。細胞周期結果顯示,槲皮素作用后， S期細胞明顯增加，G2/M期細胞相對減少，提示槲皮素主要使卵巢癌SKOV-3細胞在S期受到阻滯，阻止細胞向G2/M期移行,從而誘導凋亡，提示細胞周期阻滯為槲皮素抑制卵巢癌SKOV-3細胞生長、誘導凋亡的重要機制之一。

綜上所述，槲皮素對卵巢癌SKOV-3細胞有抑制增殖和誘導凋亡的作用，但其詳細的作用機制還有待進一步探討研究，本實驗僅僅從體外進行檢測，若能在體內深入研究及進行相關臨床實驗，明確槲皮素對卵巢癌的作用機制，有望為卵巢癌的治療方法提供實驗依據，同時也有利于槲皮素相關新藥的研發。

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EffectofquercetinonproliferationofhumanovariancancerSKOV-3cells

DENG Xiao-hui, SONG Hai-yan, SUN Chun-li

(DepartmentofHumanAnatomy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:dengxhhappy@126.com)

AIM: To study the inhibitory effect of quercetin on the proliferation and apoptosis of human ovarian cancer SKOV-3 cells.METHODSSKOV-3 cells were treated with different doses of quercetin. The inhibitory effect of quercetin on the proliferation was detected by MTT assay. The cell apoptosis was determined by immunocytochemistry. The cell cycle and apoptosis were assessed by flow cytometry.RESULTSQuercetin inhibited the proliferation of ovarian cancer SKOV-3 cells in a time- and dose-dependent manner. Quercetin induced apoptosis of SKOV-3 cells. The proportion of S phase and the apoptotic rate were significantly increased, and the proportion of G2/M phase was reduced after treatment with quercetin.CONCLUSIONQuercetin inhibits the growth of ovarian cancer SKOV-3 cellsinvitro, and promotes apoptosis through S phase arrest.

Apoptosis; Ovarian neoplasms; Quercetin

R737.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.016

1000- 4718(2013)01- 0099- 04

2012- 10- 13

2012- 12- 12

新鄉醫學院高學歷人才科研啟動項目，2011新鄉醫學院重點領域招標課題(No.ZD2011-38)

△通訊作者 Tel:0373-3029051;E-mail:dengxhhappy@126.com