HGF基因轉染對裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促進作用*

趙 行， 鄭筱嬌， 高 洲， 沈蓉蓉， 岑 東,△， 裴仁治， 羅建平， 呂建新

(1溫州醫學院浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325027； 2溫州醫學院附屬樂清醫院，樂清市人民醫院，浙江 樂清 325600； 3寧波市鄞州區疾病預防控制中心，浙江 寧波 315100； 4寧波市鄞州人民醫院，浙江 寧波 315040)

HGF基因轉染對裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促進作用*

趙 行1,2， 鄭筱嬌1， 高 洲1， 沈蓉蓉1， 岑 東1,3△， 裴仁治3， 羅建平4， 呂建新1

(1溫州醫學院浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325027；2溫州醫學院附屬樂清醫院，樂清市人民醫院，浙江 樂清 325600；3寧波市鄞州區疾病預防控制中心，浙江 寧波 315100；4寧波市鄞州人民醫院，浙江 寧波 315040)

目的探討肝細胞生長因子(HGF)基因轉染對裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促進作用及其機制。方法采用HGF基因重組質粒pVITRO2-HGF轉染的Raji細胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型，動態監測裸鼠體重和腫瘤大小；8周后獲取瘤組織，分別采用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記技術(TUNEL) 和免疫組化檢測移植瘤組織的細胞凋亡和微血管密度(MVD)，并進行相關分析。結果造模成功率為96.7%。HGF轉染組的瘤體積明顯大于HGF轉染+VP-16組(P<0.01)、未轉染組與空載體組(P<0.01)，HGF轉染+VP-16組也大于對照組(P<0.01)，未轉染組與空載體組間無顯著差異(P>0.05)。pVITRO2-HGF轉染組凋亡指數顯著低于對照組(P<0.01)，經VP-16誘導后凋亡增加(P<0.01)，但仍低于對照組(P<0.01)。pVITRO2-HGF轉染組的MVD顯著高于對照組(P<0.01)，但經VP-16誘導后血管增生降低(P<0.01)，但仍高于對照組 (P<0.05)，對照組間無顯著差異(P>0.05) 。結論HGF基因轉染可顯著促進裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生長，明顯抑制凋亡的發生，這一效應可能與其促進腫瘤血管新生和抑制腫瘤細胞凋亡有關。

肝細胞生長因子； 基因轉染； 淋巴瘤； 裸鼠； 異種移植物

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)或稱分散因子(scatter factor，SF)，是一種多功能生長因子，通過酪氨酸激酶途徑，具有促進肝細胞、上皮細胞、造血細胞等多種類型細胞的生長、遷移和形態發生的作用[1-3]。它還參與多種細胞的增殖、遷徙，對各類腫瘤的侵襲轉移有著重要的誘導作用，表明其在癌癥中扮演著重要角色。在體外的探索性實驗中，發現HGF轉染人淋巴瘤Raji細胞明顯促進增殖、遷徙、侵襲以及抗凋亡作用[4-5]。依托泊苷(etoposide,VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物, 具有廣譜的抗腫瘤活性，近年來常用于血液系統惡性腫瘤和實體瘤的治療。在此基礎上，我們擬建立人淋巴瘤Raji細胞裸鼠移植瘤模型，擬在動物水平上觀察研究HGF基因對淋巴瘤生長的促進作用及其對VP-16誘導的腫瘤細胞凋亡的抑制作用。

材 料 和 方 法

1材料

人淋巴瘤細胞系Raji細胞購自中科院上海細胞所；3周齡雄性BALB/c-nu/nu裸鼠購自中科院上海實驗動物中心，置SPF條件飼養；轉染HGF基因重組質粒pVITRO2-HGF和質粒pVITRO2的淋巴瘤細胞已由本室構建；蛋白酶K、DAB Kit和MaxVision試劑盒(兔)購自福建邁新公司；RPMI-1640購自Gibco，新生胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司；Vybrant凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen；原位細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche；兔抗人CD34單克隆抗體購自Epitomics；VP-16購自江蘇恒瑞公司；潮霉素B(50 g/L)購自Amersco。

2方法

2.1細胞的常規靜置培養 于50 mL培養瓶中用5 mL含10% BCS的RPMI-1640培養Raji細胞，37 ℃、5% CO2常規靜置培養。待細胞培養液顏色轉黃或細胞呈巨大團狀時，用吸管輕輕吹打，直至變成單個細胞，轉移置15 mL一次性離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 mL新鮮培養液，混勻，取1 mL混勻液置新培養瓶中，加入4 mL培養液，37 ℃、5% CO2常規靜置培養。取對數生長期細胞(鏡下細胞干凈而透亮)進行相關實驗。

2.2人淋巴瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立 構建3組模型：以未轉染Raji細胞組和pVITRO2-mcs轉染組為對照組，以HGF轉染組為實驗組，對照組每組5只，實驗組每組10只。分別將處對數生長期各組細胞以1 500 r/min，離心5 min，收集，無血清RPMI-1640培養液洗滌2次，重懸于無血清RPMI-1640中，調整細胞濃度為5×1010/L，按組皮下接種于10只BALB/c-nu/nu裸鼠左下肢近腹股溝處，每只0.1 mL(5×106個細胞)，構建裸鼠移植瘤模型。以注射等體積Raji細胞和轉染pVITRO2-mcs Raji細胞為對照。處理后常規飼養，動態監測各組裸鼠的生存情況和瘤體生長情況。

2.3VP-16促凋亡處理 建模成功后將實驗組分為2組，每組5只：HGF轉染組和HGF轉染+VP-16組。經尾靜脈注射100 μL VP-16，1.2 mg ·kg-1·d-1(約每只30 μg/d，7 d)，以等體積的PBS(對照組和HGF轉染組)作為對照。處理后常規飼養1周。動態監測各組裸鼠的生存情況和瘤體生長情況。

2.4裸鼠體重、腫瘤體積和抑瘤率 接種各組細胞后每7 d后用游標卡尺測量腫瘤大小，并用電子稱稱裸鼠體重，連續觀測8周后拉頸法處死全部裸鼠，剝離皮下腫瘤，測量腫瘤長、短徑。腫瘤體積(volume，V)按公式計算：V(mm3)=3.14/6×a×b2，其中a為腫瘤的長徑，b為短徑，單位為毫米(mm)。

2.5細胞凋亡指數(apoptotic index,AI)的檢測 腫瘤組織切片常規脫蠟，梯度乙醇脫水， 20 mg/L蛋白酶K室溫消化，采用TUNEL檢測細胞凋亡，中性樹脂封固，鏡下觀察。以細胞核內出現棕褐色反應物為陽性，每例切片至少計數5個200倍視野，以平均每1 000個細胞核中含凋亡細胞數作為AI，同時設陰性對照和陽性對照。

2.6腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD)的檢測 腫瘤組織切片常規脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，采用CD34(微血管標志物)免疫組化染色，中性樹脂封固，鏡下觀察。每張切片先在低倍鏡下確定5個血管密度最高區域，再在高倍鏡(200倍)下進行微血管計數。記錄5個區域視野的微血管數，取其均值作為該標本的MVD，同時設陰性對照和陽性對照。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 12.0統計軟件行方差齊性檢驗和t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義

結 果

1HGF對人淋巴瘤裸鼠模型腫瘤生長的促進作用

皮下注射2周后觀察淋巴瘤裸鼠模型，造模成功率為96.7%。8周后發現，HGF轉染組的瘤體積明顯大于HGF轉染+VP-16組(P<0.01)、未轉染組與空載體組(P<0.01)，HGF轉染+VP-16組也大于對照組(P<0.01)，未轉染組與空載體組間無顯著差異(P>0.05)，提示HGF可促進腫瘤生長，而VP-16則使腫瘤生長受抑制,見圖1、2和表1。

2細胞凋亡指數的檢測

采用TUNEL法檢測凋亡指數結果發現：接種8周后pVITRO2-HGF組凋亡指數顯著低于對照組(P<0.01)，經VP-16誘導后凋亡增加(P<0.01)，但仍低于對照組(P<0.01)，提示HGF基因轉染可明顯抑制凋亡的發生，從而促進腫瘤細胞的增殖,見圖3和表2。

Figure 1. Effect ofHGFgene transfection on the growth of lymphoma in nude mice.

圖1HGF基因轉染對裸鼠模型淋巴瘤生長的作用

Figure 2. Growth curves of the transplanted tumors.Mean±SD.n=5.**P<0.01vsRaji or pVITRO2；△△P<0.01vspVITRO2-HGF.

圖2移植瘤的生長曲線

表1HGF基因轉染對裸鼠模型淋巴瘤生長的作用

Table 1. Effect ofHGFtransfection on the growth of lymphoma in nude mice (mean±SD.n=5)

GroupMouseweight(g)Tumorvolume(mm3)Raji26.58±1.761598±178pVITRO225.71±1.001588±72pVITRO2-HGF27.20±1.453357±489**pVITRO2-HGF+VP-1626.58±2.212252±52**△△

**P<0.01vsRaji or pVITRO2；△△P<0.01vspVITRO2-HGF.

Figure 3. Effect ofHGFgene transfection on apoptosis of lymphoma in nude mice(TUNEL, ×200). A: negative control; B: positive control; C: non-transfection group; D: pVITRO2-mcs transfection group; E: pVITRO2-mcs-HGFtransfection group; F: pVITRO2-mcs-HGFtransfection+VP-16 group.

圖3HGF基因轉染對淋巴瘤細胞凋亡的影響

3腫瘤微血管密度的檢測

采用SP法染色檢測微血管密度，結果顯示：接種8周后實驗組和對照組均存在不同程度的血管增生。pVITRO2-HGF組顯著高于對照組(P<0.01)，但經VP-16誘導后血管增生降低(P<0.01)，但仍高于對照組(P<0.05)；對照組間無顯著差異(P>0.05)，提示HGF促進移植瘤的血管新生,見圖4和表2。

Figure 4. Effect ofHGFgene transfection on microvessel density of lymphoma in nude mice (SP, ×200). A: negative control; B: positive control; C: non-transfection group; D: pVITRO2-mcs transfection group; E: tumor pVITRO2-mcs-HGFtransfection group; F: pVITRO2-mcs-HGFtransfection+VP-16 group.

圖4HGF基因轉染對淋巴瘤微血管密度的影響

表2HGF基因轉染對淋巴瘤細胞凋亡和血管形成的影響

Table 2. Effects ofHGFgene transfection on cell apoptosis and angiogenesis of lymphoma in nude mice(mean±SD.n=5)

GroupApoptoticindexMicrovesseldensityRaji81.75±22.249.00±0.82pVITRO279.75±30.838.75±2.63pVITRO2-HGF 10.40±3.36**28.25±4.35**pVITRO2-HGF+VP-16 46.05±10.94**△△18.75±3.30**△△

**P<0.01vsRaji or pVITRO2;△△P<0.01vspVITRO2-HGF.

討 論

研究表明，HGF與腫瘤的發生、發展及預后有密切關系。HGF可促進細胞的有絲分裂、形態發生和遷徙，同時與血管抑制素具47%的同源性，具有促血管新生效應，還具有抑制細胞凋亡的生物學效應[6-8]，因此，HGF對于腫瘤的發生發展有著重要的作用。

目前對細胞因子促瘤作用的研究策略主要有兩類：探討直接使用蛋白的作用[7]和研究通過載體介導基因轉染后表達的間接作用[9-11]。后者目前為最常采用的，在此基礎上根據導入目標基因的方式主要可分為兩類：直接導入[9-10]和轉染后導入[9-11]。前者方法簡單，不需轉染細胞，可直接進行瘤內或腹腔內注射且可反復加強，但持續表達時間短。后者的常規策略是轉染相應的腫瘤細胞，然后進行體內或體外實驗，雖操作較復雜，但因轉入細胞后可穩定、高效表達，獲得的實驗結果也更為理想。

通過前期工作，我們成功構建了HGF基因的真核表達重組質粒，并建立穩定表達轉染細胞株。經細胞學實驗證實，HGF顯著促Raji細胞的增殖、遷徙和侵襲及抑制凋亡[12-13]。在此基礎上，我們欲證實HGF的體內生物學效應，因此建立淋巴瘤裸鼠移植瘤模型是關鍵。然而，目前未見合適的淋巴瘤裸鼠移植瘤造模方法的相關報道，也并無可供直接借鑒的資料。查閱相關文獻，在常規造模方法的基礎上，我們設計2種方法：鑒于淋巴瘤為惡性血液系統腫瘤，通過尾靜脈注射方式造模；采用實體瘤常規造方式，采用皮下或皮內注射方式造模。經預實驗發現，采用直接皮下注射，形成的瘤位置固定、成瘤時間短、造模成功率高，較尾靜脈注射方式好。因此，我們選擇皮下注射造模方式，并優化淋巴瘤細胞的活性、輸注量、輸注部位、輸注方式、裸鼠品種、飼養條件等實驗因素，造模成功率達96.7%，為后續實驗順利進行提供了保障。

觀察裸鼠模型中瘤組織生長發現，HGF基因轉染明顯促進瘤組織的生長，并拮抗VP-16對腫瘤組織的抑制。TUNEL法證實，HGF可明顯改善凋亡誘導劑對DNA的損傷(P<0.05)，較未經誘導劑處理，凋亡指數顯著降低，提示HGF基因轉染可明顯抑制腫瘤細胞凋亡的發生，從而促進腫瘤細胞的增殖。與此同時，觀察瘤組織內微血管密度，HGF明顯促進血管新生。因此，我們認為，HGF可經抑制Raji細胞和血管內皮細胞凋亡，促進淋巴瘤生長，其機制需進一步研究。

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EffectofHGFgenetransfectiononhumanlymphomaxenograftsinnudemice

ZHAO Hang1, 2, ZHENG Xiao-jiao1, GAO Zhou1, SHEN Rong-rong1, CEN Dong1, 3, PEI Ren-zhi3, LUO Jian-ping4, Lü Jian-xin1

(1ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofMedicalGenetics,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325027,China;2AffiliatedYueqingHospitalofWenzhouMedicalCollege,YueqingMunicipalHospital,Yueqing325600,China;3YinzhouDistrictCentreforDiseaseControlandPrevention,Ningbo315100,China;4YinzhouPeople’sHospital,Ningbo315040,China.E-mail:cendong2002@163.com)

AIM: To explore the promotion effect of hepatocyte growth factor (HGF) gene transfection on human lymphoma xenografts in nude mice.METHODSThe model of human lymphoma xenograft in nude mice was established by transplantation of Raji cells, which were transfected with recombinant plasmid pVITRO2-HGFharboring theHGFgene. The body weight of the nude mice and the tumor size were dynamically monitored and the tumor tissues were obtained after 8 weeks. Additionally, the methods of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry were used to detect the apoptotic index (AI) and microvessel density (MVD).RESULTSThe success rate of the human lymphoma xenografts in nude mice was 96.7%. The tumor volume inHGFtransfection group was significantly greater than that inHGFtransfection+VP-16 group and control groups (non-transfection group and empty vector group). The tumor volume inHGFtransfection+VP-16 group was also bigger than that in control groups. No difference of the tumor volume between non-transfection group and empty vector group was observed. AI inHGFtransfection group was substantially lower than that in control groups. AI inHGFtransfection+VP-16 group showed a little higher than that inHGFtransfection group, yet was still lower than that in control groups. MVD inHGFtransfection group was extraordinary higher than that in control groups, but decreased after VP-16 induction (P<0.01), which was still higher than that in control groups.CONCLUSIONHGFgene transfection significantly promotes the growth of human lymphoma xenografts in nude mice and substantially inhibits the apoptosis presumably owing to promoting tumor angiogenesis and inhibiting tumor cell apoptosis.

Hepatocyte growth factor; Gene transfection; Lymphoma; Nude mice; Xenograft

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.013

1000- 4718(2013)01- 0081- 05

2012- 06- 27

2012- 11- 13

浙江省醫藥衛生科技項目(No.2007A175);寧波市科技計劃(No. 2007C10065;No. 2010A610031)

△通訊作者 Tel： 0574-87418703； E-mail: cendong2002@163.com