SMYD3過表達(dá)對人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞miR-124表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響*

鄭禮平， 李志花△， 陳汝福， 曾 兵， 周嘉嘉， 龔遠(yuǎn)鋒， 宋亞東

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1腫瘤科， 2肝膽外科，廣東 廣州 510120)

SMYD3過表達(dá)對人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞miR-124表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響*

鄭禮平1， 李志花1△， 陳汝福2， 曾 兵2， 周嘉嘉2， 龔遠(yuǎn)鋒2， 宋亞東1

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1腫瘤科，2肝膽外科，廣東 廣州 510120)

目的探討肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810中SET和MYND結(jié)構(gòu)域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3，SMYD3)過表達(dá)對miR-124表達(dá)及細(xì)胞增殖能力的影響。方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 SMYD3 真核表達(dá)質(zhì)粒后， Western blotting 檢測細(xì)胞中SMYD3 蛋白水平的變化；qRT-PCR 檢測細(xì)胞中SMYD3 mRNA 和miR-124 表達(dá)；甲基化特異性PCR檢測miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動(dòng)子甲基化水平；CCK-8 和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果以空白組為對照，肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC-9810在轉(zhuǎn)染pEGFP-SMYD3質(zhì)粒后，SMYD3蛋白及 mRNA 表達(dá)均顯著上升(P<0.05)，miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動(dòng)子甲基化顯著增加(P<0.05),miR-124表達(dá)明顯下降(P<0.05),細(xì)胞增殖能力顯著提高(P<0.05)。結(jié)論過表達(dá) SMYD3可引起miR-124基因啟動(dòng)子甲基化增加，導(dǎo)致膽管癌細(xì)胞中miR-124 的表達(dá)下降，同時(shí)過表達(dá)SMYD3可增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力。

HCCC-9810細(xì)胞； SET和MYND結(jié)構(gòu)域含有蛋白3； miR-124； 甲基化特異性PCR； 細(xì)胞增殖

SET及MYND結(jié)構(gòu)域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3, SMYD3)包含SET和MYND兩個(gè)鋅指型功能結(jié)構(gòu)域。SET結(jié)構(gòu)域具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶功能，而MYND結(jié)構(gòu)域則與基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，從而使靶基因發(fā)生甲基化，進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和遷移等[1-2]。miR-124在多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并受DNA甲基化調(diào)控[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在膽管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染丙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis C virus core protein，HCV C)可引起miR-124表達(dá)下調(diào)[5]，同時(shí)可上調(diào)SMYD3的表達(dá)[6]。本研究通過上調(diào)膽管癌細(xì)胞SMYD3的表達(dá)，探討HCV C調(diào)控miR-124表達(dá)的潛在機(jī)制，以進(jìn)一步闡明丙型肝炎病毒的致癌機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株HCCC-9810購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自Gibco；SMYD3兔抗人單克隆抗體購自Santa Cruz；RNA提取試劑Trizol、DNA提取試劑(PureLinkTMGenomic DNA Kits)和脂質(zhì)體(lipofectamineTM2000)均購自Invitrogen；qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa。SMYD3真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-SMYD3由本課題組構(gòu)建[7]，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自廣州津美公司，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA甲基化檢測試劑盒(MethylDetectorTMBisulfite Modification Kit)購自Invitrogen；96孔板購自Corning; CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HCCC-9810細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d換液，當(dāng)細(xì)胞生長接近90%融合時(shí)，用質(zhì)量濃度0.25%胰酶消化細(xì)胞，以1∶2或1∶3比例傳代。將5×105個(gè)RBE細(xì)胞重懸于2 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h更換不含血清的新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組：A組:處理組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-SMYD3(以下簡稱SMYD3質(zhì)粒組)；B組:僅轉(zhuǎn)染空載體pEGFP(以下簡稱空載體組)；C組:空白組，僅以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24～48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后檢測。如接種在96孔板中，按說明書相應(yīng)地調(diào)整細(xì)胞數(shù)及轉(zhuǎn)染試劑量。

2.2qRT-PCR檢測SMYD3 mRNA及miR-124表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測提取RNA的濃度及純度，并確定RNA的純度在1.8～2.0之間。按qRT-PCR試劑盒操作說明書合成cDNA。 SMYD3 mRNA檢測所用的引物序列依據(jù)GenBank中NM_022743序列設(shè)計(jì)。SMYD3(106 bp)上游引物5’-GGCAGAGAACACAGCCTGAT-3’,下游引物5’-ACACGCCGTATTTCCCTCT-3’；β-actin (186 bp)上游引物5’-AAGATGACCCAGATCATGTTTGAG-3’，下游引物5’-GCAGCTCGTAGCTCTTCTCCAG-3’。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s及60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。 miR-124的熒光定量檢測試劑盒購自廣州銳博公司，U6為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s,95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。所有標(biāo)本均重復(fù)檢測3次，計(jì)算出Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

2.3Western blotting測定SMYD3蛋白的表達(dá) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，按說明書提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠電泳，各上樣孔加入25 μg蛋白樣品，電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF)膜上。PVDF膜以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入SMYD3兔抗人單克隆Ⅰ抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST漂洗3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光法試劑盒顯影、曝光。經(jīng)Bio-Rad公司的圖形分析軟件Quantity One對圖片進(jìn)行分析并測定灰度值。取SMYD3/GAPDH的灰度值之比作為蛋白的相對表達(dá)量。

2.4甲基化特異性PCR測定miR-124基因啟動(dòng)子甲基化水平 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后，按說明書提取各組DNA。按MethylDetectorTMBisulfite Modification Kit試劑盒操作說明書進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng)。引物序列參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]。miR-124-1(U)上游引物5’- AATAAAGAGTTTTTGGAAGATGTT -3’,下游引物5’- AAAAAAATAAAAAACAACACATATAC -3’；miR-124-1(M)上游引物5’- AAAGAGTTTTTGGAAGACGTC -3’，下游引物5’- AATAAAAAACGACGCGTATA -3’。miR-124-2(U)上游引物5’- GGGGTAATTAATTTGGATTTATGTT -3’，下游引物5’- AAAACCACTATTAATTAATCTATTCCA -3’ ；miR-124-2(M)上游引物5’- GGGTAATTAATTTGGATTTACGTC -3’,下游引物5’- ACCGCTATTAATTAATCTATTCCG -3’。miR-124-3(U)上游引物5’- GGGTGAGGATTTTATGTAAGTTT -3’,下游引物5’- TTCACCACATACCTTAATTATATAAAC -3’；miR-124-3(M)上游引物5’- GCGAGGATTTTACGTAAGTTC-3’,下游引物5’- CCGCGTACCTTAATTATATAA -3’。甲基化特異性PCR條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(miR-124-1退火溫度58 ℃，miR-124-2及miR-124-3的退火溫度為55 ℃)，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，于凝膠成像系統(tǒng)拍攝并分析結(jié)果。

2.5CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況 取處于對數(shù)期生長的HCCC-9810細(xì)胞，接種于96孔板，每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，約70%～80%融合后，轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)分為SMYD3質(zhì)粒組、空載體組和空白對照組。分別在轉(zhuǎn)染10 h、15 h、20 h、25 h、30 h、35 h和40 h后，更換為不含血清的新鮮培養(yǎng)基，并向每孔加入10 μL CCK-8試劑。置于37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光值，每個(gè)時(shí)點(diǎn)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.6平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將3×108/L HCCC-9810細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后將細(xì)胞用胰酶消化后吹散成單細(xì)胞懸液， 取1 000個(gè)細(xì)胞接種于中皿， 每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)分為SMYD3質(zhì)粒組、空載體組和空白對照組。于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用多聚甲醛固定， 1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)算克隆形成數(shù)(含有10 個(gè)細(xì)胞以上的集落為1個(gè)克隆)，克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1轉(zhuǎn)染后SMYD3mRNA及蛋白表達(dá)

qRT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染SMYD3質(zhì)粒組的SMYD3 mRNA 表達(dá)水平均較空白組明顯升高，比值為5.146±0.124，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染空載體組與空白組相比SMYD3 mRNA表達(dá)水平則無明顯差異，比值為1.213±0.087(P>0.05),見圖1。Western blotting 結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染SMYD3質(zhì)粒組的 SMYD3蛋白表達(dá)水平較空白組明顯升高，灰度比值為2.832±0.132，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染空載體組與空白組的 SMYD3蛋白表達(dá)水平則無明顯差異，灰度比值為1.115±0.069(P>0.05),見圖2。

圖1HCCC-9810細(xì)胞SMYD3mRNA的表達(dá)

圖2HCCC-9810細(xì)胞SMYD3蛋白的表達(dá)

2甲基化特異性PCR結(jié)果

甲基化特異性PCR結(jié)果顯示,SMYD3質(zhì)粒組miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動(dòng)子甲基化水平顯著上調(diào)，比值分別為3.524±0.105、3.002±0.099和2.892±0.087，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而空載體組與空白組相比，三者表達(dá)水平則無明顯差異(比值分別為1.106±0.033、1.098±0.053和0.998±0.047)，見圖3。

Figure 3. Methylation ofmiR-124 gene in HCCC-9810 cells. U: unmethylated; M: methylated. 1: blank group; 2: empty plasmid group; 3: SMYD3 plasmid group.

圖3HCCC-9810細(xì)胞miR-124基因的甲基化

3SMYD3對miR-124表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染SMYD3質(zhì)粒組的miR-124表達(dá)水平均較空白組明顯下降，比值為0.345±0.014，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染空載體組與空白組miR-124表達(dá)水平則無明顯差異，比值為0.976±0.025(P>0.05),見圖4。

圖4HCCC-9810細(xì)胞miR-124的表達(dá)

4SMYD3對細(xì)胞生長曲線的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染SMYD3質(zhì)粒組細(xì)胞在25 h～40 h，吸光度值顯著高于空白組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞與空白組細(xì)胞相比無顯著差異(P>0.05),見圖5。

5平板克隆實(shí)驗(yàn)

各組克隆形成率：SMYD3質(zhì)粒組為48.3%±3.3%，空載體組為16.5%±2.1%，空白組為18.3%±2.4%。SMYD3質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于空白組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而空載體組細(xì)胞與空白組無明顯差異(P>0.05),見圖6。

圖5HCCC-9810細(xì)胞增殖曲線

圖6HCCC-9810細(xì)胞的克隆形成率

討 論

MicroRNA (miRNA) 是生物體內(nèi)長度約為 21～23個(gè)核苷酸的非編碼小 RNA, 廣泛存在于各種動(dòng)植物中。miRNA 與相關(guān)蛋白形成 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，結(jié)合靶基因mRNA，通過抑制蛋白質(zhì)的翻譯下調(diào)特異性基因的表達(dá)[9]。miRNA能控制細(xì)胞的生長、分化和凋亡，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常關(guān)鍵的作用，已成為腫瘤細(xì)胞與分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中最受關(guān)注的生物分子之一[9-10]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在著miRNA的異常表達(dá)。miRNA 基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島發(fā)生異常甲基化可以導(dǎo)致某些關(guān)鍵 miRNA 表達(dá)紊亂[11]。

miR-124在多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，包括肝癌、髓母細(xì)胞瘤、口腔鱗癌等，miR-124在其中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長、降低腫瘤侵襲性的作用[3-5]。成熟的miR-124由3種前體加工而成，miR-124-1(位于染色體8p23.1)、miR-124-2(位于染色體8q12.3)和miR-124-3(位于染色體20q13.33)。SMYD3在肝癌、膽管癌、乳腺癌、宮頸癌等中表達(dá)增高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、增殖和侵襲[ 1-2,6,12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在膽管癌細(xì)胞中SMYD3的表達(dá)受miR-124的調(diào)控[5-6]，且SMYD3可以引起抑癌基因RASSF1A啟動(dòng)子的甲基化，使RASSF1A表達(dá)下降，上調(diào)SMYD3可以引起DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3B表達(dá)升高，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖[6,13]。因此，我們推測，SMYD3和miR-124之間可能存在一個(gè)負(fù)反饋調(diào)控的關(guān)系：即miR-124在調(diào)控SMYD3表達(dá)的同時(shí)，反過來又受到SMYD3的調(diào)控。

本研究中，HCCC-9810細(xì)胞在轉(zhuǎn)染SMYD3 質(zhì)粒后，SMYD3 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯上升，而轉(zhuǎn)染空載體組變化不明顯，表明轉(zhuǎn)染是成功的。過表達(dá)SMDY3能夠顯著上調(diào)miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動(dòng)子甲基化水平，miR-124表達(dá)亦明顯降低，提示SMYD3可以通過誘導(dǎo)miR-124基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化而下調(diào)miR-124的表達(dá)。本研究提示，在HCV相關(guān)膽管癌中，可能存在一個(gè)由HCV C誘導(dǎo)形成的SMYD3-miR-124的負(fù)反饋通路，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

SMYD3可直接或間接影響細(xì)胞中原癌基因蛋白(c-Met、JunD、Wnt10B等)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(CDK2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ等)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白(RAB40C、GNRF2等)的表達(dá)量，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14-15]。本研究中，CCK-8及平板克隆增殖結(jié)果均提示SMYD3可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

綜上所述，SMYD3可引起組蛋白的甲基化修飾導(dǎo)致DNA甲基化酶的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)miR-124基因啟動(dòng)子甲基化來調(diào)控miR-124的表達(dá)。此外，過表達(dá)SMYD3可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖。本研究揭示了膽管癌中miR-124表達(dá)調(diào)控的新機(jī)制，有望為膽管癌的臨床研究提供潛在可行的治療靶點(diǎn)。

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EffectofSMYD3over-expressiononmiR-124expressionandproliferationabilityinhumanintrahepaticcholangiocarcinomacells

ZHENG Li-ping1, LI Zhi-hua1, CHEN Ru-fu2, ZENG Bing2, ZHOU Jia-jia2,GONG Yuan-feng2, SONG Ya-dong1

(1DepartmentofOncology,2DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:lzhzsdxsyx@126.com)

AIM: To explore the effect of SET and MYND domain-containing protein 3 (SMYD3) over-expression on miR-124 expression and proliferation ability of human intrahepatic cholangiocarcinoma cells.METHODSTransient transfection of SMYD3 eukaryotic expression plasmid into human intrahepatic cholangiocarcinoma cell line HCCC-9810 were performed. The expression of SMYD3 at mRNA and protein levels was measured by qRT-PCR and Western blotting, respectively. The expression ofmiR-124 was detected by qRT-PCR, and the methylation status ofmiR-124 gene was determined by methylation-specific PCR. Cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation experiment.RESULTSAfter transfected with SMYD3 eukaryotic expression plasmid, the over-expression of SMYD3 in HCCC-9810 cells was observed. Compared with the blank cells, the expression level of miR-124 was significantly decreased andmiR-124 gene promoter methylation was significantly increased. In addition, SMYD3 over-expression significantly promoted the proliferation of HCCC-9810 cells.CONCLUSIONThe transient transfection of SMYD3 plasmid increases the methylation ofmiR-124 gene promoter and induces under-expression of miR-124. Over-expression of SMYD3 promotes the proliferation of cholangiocarcinoma cells.

HCCC-9810 cells; SET and MYND domain-containing protein 3; miR-124; Methylation-specific PCR; Cell proliferation

R735. 8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.012

1000-4718(2013)01-0076-05

2012-07-20

2012-10-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30872485)

△通訊作者 Tel: 020-81332107; E-mail: lzhzsdxsyx@126.com