鼻腔滴入胰島素改善2型糖尿病大鼠海馬阿爾茨海默病樣改變*

楊 雁， 馬德琳， 王玉萍， 姜 騰， 胡蜀紅， 余學鋒

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院內分泌科， 湖北 武漢 430030)

鼻腔滴入胰島素改善2型糖尿病大鼠海馬阿爾茨海默病樣改變*

楊 雁， 馬德琳， 王玉萍， 姜 騰， 胡蜀紅， 余學鋒△

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院內分泌科， 湖北 武漢 430030)

目的2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)時大腦出現胰島素水平下降及胰島素信號通路下調，使大腦海馬tau蛋白出現過度磷酸化的阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)樣改變。本研究選取2型糖尿病大鼠，皮下注射及鼻腔滴入胰島素，觀察大腦AD樣病變的改變，并探討其機制。方法高糖、高脂、高蛋白喂飼3個月后鏈脲佐菌素腹腔注射制備T2D大鼠模型。運用2種方法干預：鼻腔滴入胰島素(T2D+I-I)及皮下注射胰島素(T2D+S-I)。檢測血漿葡萄糖、血漿胰島素和腦脊液胰島素水平，免疫印記方法檢測大腦海馬總tau蛋白和tau蛋白部分位點磷酸化狀態、胰島素信號轉導途徑中關鍵酶磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt及糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)活性。結果T2D組大鼠血漿葡萄糖及胰島素水平顯著升高，腦脊液胰島素水平顯著降低，大腦海馬組織中tau蛋白呈過度磷酸化狀態，PI3K/Akt活性下降， GSK-3β磷酸化水平升高； T2D+I-I組大鼠血漿胰島素及葡萄糖水平無顯著改變，但大腦海馬tau蛋白過度磷酸化狀態顯著好轉，PI3K/Akt活性顯著升高，GSK-3β活性顯著下降； T2D+S-I組大鼠血糖顯著下降，但血漿及腦脊液胰島素水平無顯著改變，大腦海馬tau蛋白磷酸化水平有輕度改善，但變化不顯著。結論運用鼻腔滴入胰島素可減輕T2D時大腦海馬組織的AD樣病變；外周皮下胰島素注射對T2D時AD樣病變無明顯作用。

阿爾茨海默病； 2型糖尿病； 胰島素； Tau蛋白過度磷酸化； 胰島素信號途徑

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)是最常見的內分泌代謝病。阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種神經退行性疾病，占成人癡呆癥的60%[1]。隨著人們生活方式的改變(能量攝入增加和運動減少等)及人口老齡化，T2D及AD患者人數急劇上升。流行病學資料顯示，T2D人群較非T2D人群發生AD的風險要上升1.5～2.5倍[2-3]。因此，探討T2D時導致AD發病風險增高的原因并尋求有效的治療藥物具有重要臨床意義。

AD最早出現的典型病理生理改變是大腦海馬組織中tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)和淀粉樣β肽(amyloid β-peptide, Aβ)聚集形成老年斑，其中tau蛋白過度磷酸化由于先于Aβ聚集出現，被稱為AD樣(AD-like)改變[4]。有研究發現在8周齡的糖尿病模型db/db小鼠中，大腦海馬tau蛋白已呈過度磷酸化的AD樣改變，并且這種改變隨著小鼠周齡的增長而逐漸加重[5]。Tau蛋白磷酸化狀態受蛋白激酶與蛋白磷酸酶的雙重調節，其中糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)是tau蛋白的重要磷酸激酶，其活性上升可導致tau蛋白上大多數位點發生過度磷酸化改變[5-6]。

T2D特征性表現為高胰島素血癥、外周組織胰島素抵抗和血葡萄糖產生增加。我們前期的研究及國外的研究證實： (1)T2D時，大腦組織呈AD樣病變[7]；(2)大腦海馬細胞內GSK-3β活性上升，導致大腦海馬內tau蛋白出現過度磷酸化，促進AD的發生[8]；(3)T2D時，雖然外周胰島素水平顯著升高，但大腦胰島素水平卻沒有升高，反而出現下降，這可能與血腦屏障對胰島素的轉運下降有關[9-10]；(4)T2D時，大腦胰島素信號途徑中重要組成部分磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt活性下降，從而導致其下游即tau蛋白磷酸激酶GSK-3β活性反饋性增高[11-12]。以上實驗結果表明，大腦胰島素水平的下降和胰島素信號途徑的激活減弱是導致T2D時AD形成的重要因素之一，因此，改善下降的大腦胰島素水平及增強胰島素信號通路可能是減少T2D時AD發病的重要靶點之一。

本研究選取2型糖尿病大鼠，通過皮下注射胰島素或鼻腔滴入胰島素2種方式改善大腦胰島素水平，通過檢測干預前后大腦海馬tau蛋白磷酸化水平及胰島素信號轉導途徑中各酶活性，來探討T2D時大腦胰島素水平異常作為AD發病重要風險因素的原因。本研究將對降低T2D患者AD發病風險的治療有重要意義。

材 料 和 方 法

1動物模型

1.1T2D大鼠模型的制備 雄性SD大鼠(華中科技大學同濟醫學院動物中心提供)54只，體重150～180 g，10～12周齡，其中隨機42只給予高脂高糖高蛋白飲食[熱卡百分比為碳水化合物26%，蛋白質15.2%，脂肪(煉豬油)58.8%] 3個月，按照30～35 mg/kg劑量尾靜脈一次性注射STZ(Sigma，粉劑溶于0.1 mol/L pH 4.3檸檬酸鈉緩沖液中)，72 h后尾靜脈取血，血糖儀(強生穩豪)測血糖≥16.7 mmol/L、尿糖持續陽性為造模成功，42只高脂高糖高蛋白飲食+STZ小劑量注射大鼠中，36只血糖高于入選標準，納入2型糖尿病組(T2D組)。另外12只給予普通飲食喂養，并按照上述方法尾靜脈注射檸檬酸緩沖液(CTL組)。

1.2T2D大鼠胰島素干預 隨機將36只T2D大鼠分為3組，均繼續高脂高糖高蛋白飲食，11只給予皮下胰島素注射(subcutaneous insulin injection，S-I)，劑量為0.1 U/kg(T2D+S-I,n=11)，每天1次。12只給予鼻腔滴入胰島素(intranasal insulin treatment，T2D+I-I,n=12)，按照Dhuria等[13]的方法，麻醉大鼠，取仰臥位，將大鼠頭部與身體角度處于70～90度，將胰島素通過移液器送入鼻腔，胰島素濃度為4×104U/L，每次每只大鼠用量1 U,即25 μL， 5 μL交替滴鼻，共滴5次，每次間隔1 min，每天給藥1次。T2D+S-I組及T2D+I-I組均空腹過夜， 8:00 AM給予胰島素后即可進食。胰島素種類均使用短效胰島素(諾和靈R，諾和諾德天津制藥有限公司)。未經胰島素干預的T2D組大鼠(n=13)給予25 μL生理鹽水滴鼻，每次5 μL，共滴5次，每次間隔1 min。干預4周以后，與進食普通飼料的CTL大鼠同時斷頸處死。

實驗過程中，大鼠單籠飼養于恒溫(25 ℃)的清潔級動物房中，每天光照12 h，T2D組、T2D+I-I組及T2D+S-I組給予胰島素或生理鹽水干預后投食，CTL組大鼠可自由進食。各組大鼠自由飲水，除胰島素干預外未經任何降糖藥物處理。

2觀察指標及方法

2.1一般指標

2.1.1血糖(plasma glucose) 處死前由尾靜脈采血，用血糖儀檢測血糖水平。

2.1.2血漿胰島素(plasma insulin) 處死前心臟取血1mL，離心后取血漿，-20℃保存，放免法1次性檢測。試劑盒購自北京原子能研究所， 測定值批內CV<2.5%，批間CV<3.5%。

2.1.3胰島素抵抗指標 以穩態模型的胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resis-tance,HOMA-IR)表示,HOMA-IR=FINS(fasting insulin, U/L)×FPG (fasting plasma glucose, mmol/L)/22.5。

2.1.4腦脊液胰島素 (cerebrospinal fluid insulin，CSF insulin) 參照Hoistad等[14]的方法，運用20%烏拉坦將大鼠麻醉以后，剪開頭部皮膚，清理組織和肌肉，暴露小腦及延髓部，運用注射器針頭在腦膜上開孔，向內插入細管，將細管末端低于頭部，等待腦脊液自動流出，收集20～50 μL以檢測腦脊液胰島素水平。

2.2蛋白質印跡方法分析各組大鼠大腦海馬組織內總tau蛋白和tau蛋白部分位點的磷酸化水平,胰島素信號轉導途徑中總Akt、磷酸化Akt、總GSK-3β及磷酸化GSK-3β的水平 處死動物，取出一側大腦海馬組織。一部分放入勻漿器內，加入蛋白質提取液，冰上勻漿。蛋白質提取液:40 mmol/L Tris-HCl， pH 7.0，1% Triton X-100，0.2% SDS，1.0 mmol/L脫氧膽酸鈉，1.0 mmol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF， 1.0 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)，2.0 mg/L抑肽酶(aprotinin)、 亮抑蛋白酶肽(leupeptin)和抑肽素(pepstatin)，1.0 mmol/L EGTA,1.0 mmol/L EDTA(以上試劑購自武漢凌飛科技公司)。于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清即為蛋白質。取10 μL用Bradford法檢測蛋白質濃度，余儲存于-80 ℃備用。用前加2×樣本緩沖液并混勻，于100 ℃變性5 min。每孔內加入約12 μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，結束后全濕轉至NC膜。搖床上5%BSA封閉2 h；雜交Ⅰ抗(所有抗體如表1所示)4 ℃過夜；PBST洗膜3次，每次10 min；雜交Ⅱ抗(辣根酶標記的羊抗兔、羊抗鼠及兔抗羊IgG購自Pierce)，室溫搖床上1 h；PBST洗膜3次，每次10 min； ECL顯色，最后用膠片感光。運用BandScan 5.0軟件對免疫反應條帶進行定量分析。

表1 研究所用Ⅰ抗

p-tau: phosphorylated tau; NP-tau: non-phosphorylated tau.

3統計學處理

用Prism 4.0進行統計處理。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，各組均數間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有顯著意義。

結 果

1各組大鼠血糖、血漿胰島素、腦脊液胰島素水平及胰島素抵抗程度的比較

T2D組血糖水平及血漿胰島素水平顯著高于CTL組，但腦脊液胰島素水平顯著低于CTL組。T2D+S-I組大鼠血糖水平較T2D組顯著降低，血漿胰島素水平較T2D組顯著增高，但腦脊液中胰島素水平無顯著變化。T2D+I-I組大鼠血糖水平及血漿胰島素水平與T2D組比較無顯著改變，但腦脊液胰島素水平較T2D組顯著增高，并與CTL組相比無顯著差異。運用HOMA-IR公式評估的胰島素抵抗程度結果顯示，T2D組胰島素抵抗程度顯著高于CTL組，經胰島素干預的2組大鼠外周胰島素抵抗程度與T2D組比較無顯著差異，表明2種胰島素干預措施均不能改善T2D的胰島素抵抗狀態,見表2。

2免疫印跡方法檢測大鼠海馬內總tau蛋白和tau蛋白磷酸化水平

如圖1所示，T2D組及經胰島素干預后的T2D+S-I組和T2D+I-I組大腦海馬總tau蛋白與CTL組比較無顯著差異。此結果說明，外周的高胰島素血癥、高血糖癥及腦脊液中的胰島素缺乏均對總tau蛋白無影響，并且運用胰島素干預后總tau蛋白亦無顯著改變。

表2 各組大鼠的體重和實驗室檢查指標

*P<0.05,**P<0.01vsCTL;#P<0.05,##P<0.01vsT2D.

選擇tau蛋白的磷酸化位點Ser199、Ser202及Ser396，通過檢查其磷酸化程度來說明tau蛋白磷酸化水平。 如圖1所示，T2D組大鼠大腦海馬tau蛋白在以上3個位點均呈過度磷酸化表現，在Ser199和Ser202這2個位點的非磷酸化水平較CTL組顯著下降； T2D+S-I組tau蛋白在Ser199/202位點上磷酸化程度較T2D組有減輕，但不顯著，這2個位點的非磷酸化水平與T2D組相比無顯著差異,而Ser396位點的磷酸化水平較T2D組明顯減低；運用鼻腔滴入胰島素干預后tau蛋白在Ser199/202及Ser396位點上過度磷酸化程度較T2D組顯著減輕,Ser199/202位點的非磷酸化水平較T2D組顯著升高。

Figure 1. Western blotting analysis of total tau level and phosphorylation of tau.Mean±SD.*P<0.05vsCTL;#P<0.05vsT2D.

圖1免疫印跡技術檢測大鼠大腦海馬總tau蛋白及tau蛋白部分位點的磷酸化水平

3免疫印跡方法檢測大鼠大腦海馬內胰島素信號途徑中PI3K/Akt/GSK-3β的活性

胰島素信號轉導途徑中PI3K活性通過其下游Akt活性來評估，當磷酸化Akt/總Akt比例越高，則Akt活性越高,即表示PI3K活性越高；而GSK-3β位于PI3K/Akt下游，其活性受Akt抑制，本研究選取磷酸化GSK-3β(Ser9)與總GSK-3β的比值來評估GSK-3β活性，比值越大，則GSK-3β活性越低。

如圖2所示，各組總Akt水平無顯著異常，T2D組大鼠大腦海馬磷酸化Akt水平下降，T2D+S-I組中Akt磷酸化程度與T2D比較無顯著改變，但T2D+S-I組Akt的磷酸化程度有上升；各組總GSK-3β水平無顯著改變，T2D組大鼠大腦海馬磷酸化GSK-3β水平下降，T2D+S-I組及T2D+I-I組GSK-3β的磷酸化程度均有所有上升，其中，T2D+I-I組GSK-3β磷酸化程度較T2D組上升更明顯。

討 論

Tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結是AD最早出現的病理生理改變之一，其出現要遠早于AD的臨床癥狀出現，因此被稱為AD樣改變。Tau蛋白上大部分位點的過度磷酸化改變均與GSK-3β活性有關，GSK-3β活性增高可導致tau蛋白上大多數位點的過度磷酸化改變[11, 15-17]；除此之外，GSK-3β位于胰島素信號轉導途徑中，當胰島素抵抗形成或胰島素絕對缺乏，胰島素信號轉導途徑下降，位于PI3K下游的GSK-3β活性上升[11]。

前期研究證實，2型糖尿病大鼠大腦胰島素缺乏，導致大腦胰島素信號途徑下調，位于胰島素信號途徑中位于PI3K/Akt下游的G3K-3β活性升高，最終導致海馬組織tau蛋白出現AD樣病變。Lee等[18]的研究顯示，在對高分化海馬神經細胞的培養基中加入胰島素，可導致Aβ沉積下降；對AD小鼠海馬定位注射胰島素，可顯著改善其認知功能。這些研究資料提示，AD大腦中由于低胰島素水平導致的AD樣病變可以通過注射胰島素得到改善。有研究顯示，外周胰島素無法自由通過血腦屏障，但鼻腔滴入胰島素可直接增加腦脊液胰島素水平[19]。因此，本研究采用2種方法改善大腦胰島素缺乏狀態，旨在恢復大腦胰島素信號途徑，降低AD病變的發生。結果顯示，運用外周胰島素注射，可降低血漿血糖，但對血漿胰島素水平、腦脊液胰島素無影響，tau蛋白的過度磷酸化無顯著改變；運用鼻腔滴入胰島素后對血漿血糖、血漿胰島素無顯著影響，但增高了大腦胰島素水平，tau蛋白過度磷酸化狀態得到改善。

Figure 2. Western blotting analysis of Akt, GSK-3β and their phosphorylation.Mean±SD.*P<0.05vsCTL;#P<0.05vsT2D.

圖2免疫印跡方法檢測大腦胰島素信號途徑中Akt及GSK-3β活性

為了進一步探討鼻腔滴入胰島素治療對tau蛋白磷酸化狀態影響的機制，本研究檢測了大腦胰島素轉導途徑中關鍵酶PI3K/Akt及下游GSK-3β活性，結果表明，鼻腔滴入胰島素導致大腦胰島素水平增高后，可顯著改善胰島素信號轉導途徑，表現為PI3K/Akt活性增高，其下游的GSK-3β活性受抑，tau蛋白過度磷酸化逆轉，從而改善大腦AD樣改變。

綜上所述，本研究發現T2D大鼠大腦呈AD樣改變，與大鼠大腦內胰島素水平降低、胰島素信號轉導途徑關鍵酶活性下調密切相關。外周給予T2D大鼠胰島素注射不能直接通過血腦屏障進入大腦，因此不能升高大腦胰島素水平，tau蛋白AD樣病變改善不明顯，但鼻腔滴入胰島素可直接升高腦脊液胰島素水平，胰島素信號轉導途徑恢復，AD樣病變可得到改善。本研究為T2D導致 AD發病的原因提供理論依據，并為T2D時降低AD的發病風險提供治療途徑依據。

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IntranasalinsulintreatmentamelioratesAlzheimerdisease-likechangesinhippocampusinaratmodeloftype2diabetes

YANG Yan, MA De-lin, WANG Yu-ping, JIANG Teng, HU Shu-hong, YU Xue-feng

(DepartmentofEndocrinology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:xfyu188@163.com)

AIM: To investigate Alzheimer disease (AD)-like changes and 2 key components of the insulin signaling pathway in the brain of a rat model of type 2 diabetes (T2D) after insulin treatment.METHODSThe rat model of T2D was established by feeding a high-protein, high-glucose and high-fat diet followed by intrasubcutaneous injection of streptozocin. Intranasal insulin treatment (T2D+I-I) and subcutaneous insulin injection (T2D+S-I) were applied to elevate the insulin level in the brain. The insulin levels in plasma and cerebrospinal fluid as well as the concentration of plasma glucose were measured. Total tau level, the phosphorylation level of tau at some phosphorylation sites, and the activation of GSK-3β and Akt in subcutaneous of the rats were also analyzed by Western blotting.RESULTSAD-like changes, decreased Akt activation and over-activation of GSK-3β in the hippocampus of the T2D rats were observed. Intranasal insulin treatment for 4 weeks normalized the levels of Akt and GSK-3β, as well as reduced the AD-like changes in the hippocampus of the T2D rats, whereas the treatment with insulin by subcutaneous injection for 4 weeks had minimal effects on the levels of GSK-3β and tau phosphorylation in the hippocampus.CONCLUSIONIntranasal insulin treatment, but not subcutaneous insulin treatment, might decrease the risk of AD in T2D rats by reducing AD-like changes and up-regulating the impaired insulin signaling pathway in the hippocampus,indicating the potential use of intranasal insulin delivery for treatment of AD.

Alzheimer disease; Type 2 diabetes; Insulin; Tau hyperphosphorylation; Insulin signaling pathway

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.009

1000- 4718(2013)01- 0056- 06

2012- 06- 25

2012- 11- 19

國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81100582)；教育部博士點新教師基金資助項目(No.200804871047)；湖北省衛生廳一般項目(No.JX5B04)

△通訊作者 Tel： 027-83662883；E-mail： xfyu188@163.com