西洋參莖葉總皂苷通過抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷*

王 琛, 劉 蜜, 孫 勝, 宋丹丹, 劉秀華△, 史大卓△

(解放軍總醫(yī)院 1中醫(yī)科, 3病理生理研究室, 北京 100853； 2中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院, 北京100091)

西洋參莖葉總皂苷通過抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷*

王 琛1,2, 劉 蜜2, 孫 勝3, 宋丹丹3, 劉秀華3△, 史大卓2△

(解放軍總醫(yī)院1中醫(yī)科,3病理生理研究室, 北京 100853；2中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院, 北京100091)

目的觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對大鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷的保護作用，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的角度探討其可能的分子機制。方法采用SD大鼠心肌I/R模型，隨機分為正常對照組、模型組與藥物預(yù)處理組，檢測血流動力學(xué)及血清心肌肌鈣蛋白T(cTnT)含量，以氯化三苯基四氮唑(TTC)和伊文思藍雙染法檢測心梗面積，采用HE染色和TUNEL法分別評估心肌病理損傷和心肌細胞凋亡程度，Western blotting法檢測心肌組織凋亡調(diào)節(jié)因子以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果與I/R組相比，PQS+I/R組平均動脈壓降低32.0%(P<0.05)，左室±dp/dtmax分別升高64.0%和35.0%(P<0.05)，血清cTnT含量降低53.3%(P<0.05)，壞死面積/缺血面積(AN/AAR)百分比降低65.5%(P<0.05)，心肌細胞凋亡率降低54.9%(P<0.05)；心肌組織病理損傷程度減輕；抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高110.0%(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達降低47.8%(P<0.05),鈣網(wǎng)蛋白(CRT)表達降低43.4%(P<0.05)，C/EBP同源蛋白(CHOP)和剪切后的caspase-12蛋白表達分別降低38.6%和23.7%(P<0.05)。結(jié)論PQS可顯著減輕大鼠心肌I/R損傷，其機制與降低I/R誘導(dǎo)的CRT過表達，抑制CHOP、caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路激活，從而抑制過度ERS介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。

西洋參莖葉總皂苷； 缺血/再灌注； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

西洋參莖葉總皂苷(Panaxquinquefoliumsaponins, PQS) 是西洋參莖葉中主要的活性成分。以往實驗研究表明，PQS具有減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和心律失常、改善梗死后心室重構(gòu)等作用[1-3]，其機制可能與增強抗氧化酶活性、維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等有關(guān)[4]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum, ER) 是細胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場所。缺血缺氧、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起ER功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (endoplasmic reticulum stress, ERS),表現(xiàn)為ERS標志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)和鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin, CRT) 的表達。持續(xù)而嚴重的ERS可誘導(dǎo)ERS相關(guān)細胞凋亡途徑如CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白 (CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP) 和caspase-12的激活,加重I/R損傷[5-6]。我們前期研究表明PQS可通過抑制ERS相關(guān)細胞凋亡而減輕離體培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷[7]。PQS對大鼠心肌缺血/再灌注模型是否具有相同的作用，其機制是否與抑制過度ERS有關(guān)，尚缺少研究。因此本研究旨在證明PQS是否通過抑制過度ERS而減輕大鼠心肌I/R損傷。

材 料 和 方 法

1藥品和試劑

PQS粉由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供；TUNEL試劑盒購自Promaga；氯化三苯基四氮唑 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)和伊文思藍均購自Sigma；蛋白電泳分子量為7～175 kD，為Bio-Rad產(chǎn)品；兔抗人CRT、caspase-12和GRP78多克隆抗體均購自Stressgen；兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人CHOP單克隆抗體、兔抗人Bax和Bcl-2多克隆抗體均購自Cell Signal；增強化學(xué)發(fā)光 (ECL) 試劑盒購自Millipore；辣根過氧化酶標記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG均購自Santa Cruz。

2動物模型建立

清潔級健康SD大鼠，雌雄各半，體重(150±20)g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[許可證號為SCXK-(軍)2007-004]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。術(shù)前禁食12 h，自由飲水，以2%戊巴比妥鈉 (2.3 mL/kg) 腹腔注射麻醉后固定于鼠臺，氣管插管，采用微型動物呼吸機(浙江大學(xué)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)) 支持呼吸，頻率50～60 min-1，潮氣量4～6 mL。連接SMUP-PC1型生物信號處理系統(tǒng)，以MFL Lab200心電軟件(復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室研制)記錄標準導(dǎo)聯(lián)心電圖。按照既往報道方法[8]復(fù)制心肌I/R模型：胸骨正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，在胸骨左緣3、4 肋間開胸暴露心臟。打開心包膜，揭開脂肪墊，暴露左心耳后，持7號針線，在肺動脈圓錐和左心耳之間冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary, LAD) 處穿一縫合線，將充水(0.5 mL) 的球囊墊于血管與結(jié)扎線之間，結(jié)扎造成心肌缺血。心電圖監(jiān)測顯示進行性心肌缺血變化后證明造模成功，45 min后，抽出球囊，關(guān)胸，再灌注24 h。結(jié)束實驗時，動脈取血，用于血清肌鈣蛋白(cardiac troponin,cTnT)測定，按照不同檢測指標分別留取心肌組織標本迅速液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜谥苽浣M織切片或進行心肌梗死面積測定。

3實驗分組

隨機分為3組，每組15只。(1)假手術(shù) (sham) 組：與藥物組等量飲用水灌胃，每天1次，連續(xù)6周，開胸后穿線，但不結(jié)扎冠狀動脈左前降支；(2)I/R組：與藥物組等量飲用水灌胃，每天1次，連續(xù)6周，開胸后可逆性結(jié)扎冠狀動脈左前降支致心肌缺血45 min，再灌注24 h；(3)藥物預(yù)處理(PQS+I/R)組：(根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果)270 mg·kg-1·d-1PQS水溶液灌胃，每天1次，連續(xù)6周后進行與I/R組相同的干預(yù)。

4觀察指標

4.1心率(heart rate,HR)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)和左室壓上升、下降最大速率(±dp/dtmax)測定 實驗結(jié)束時，大鼠稱重，2%戊巴比妥腹腔麻醉，固定后分離右側(cè)頸總動脈，將PE-50 導(dǎo)管插入頸總動脈經(jīng)壓力傳感器與SMUP-PC1型生物信號處理系統(tǒng)相連。穩(wěn)定10 min后，描計頸動脈波形,再將導(dǎo)管送入左室，描計左心室壓力曲線。以MFL Lab200心功能軟件記錄HR、MAP和±dp/dtmax。

4.2血清cTnT含量測定 經(jīng)動脈插管抽取血液約5 mL，肝素抗凝，1 000 r/min離心10 min，收集血清，液氮速凍，-80 ℃保存。以全自動生化分析儀(日立公司)測定血清心肌損傷標志物cTnT的含量。

4.3心梗面積測定 按照文獻[9]報道方法，實驗結(jié)束后原位結(jié)扎左冠狀動脈前降支，經(jīng)主動脈逆行灌注1%伊文思藍2 mL，將非缺血區(qū)藍染，顯示出缺血區(qū)心肌。取出心臟，去除左右心房，置于-20 ℃冷凍20 min，垂直其長軸橫切為5片厚約2 mm的心肌片，按順序置人2% TTC磷酸緩沖液中，避光37 ℃孵育10 min，此時梗死區(qū)為灰白色，即壞死面積(area of necrosis，AN)；缺血非梗死區(qū)呈磚紅色，缺血區(qū)面積(area at risk，AAR)為灰白區(qū)與磚紅色區(qū)之和，正常區(qū)為藍色。掃描儀掃描成像，以Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4．1) 分別計算各部分面積，缺血心肌用AAR與左心室(left ventricle，LV)面積之比表示，梗死范圍以AN與AAR之比表示。

4.4心肌細胞凋亡測定 經(jīng)頸動脈取血后，取出心臟，將缺血區(qū)心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，4%甲醛固定1周，常規(guī)石蠟包埋，制備3 μm切片。采用TUNEL法，按照試劑盒說明進行心肌組織切片細胞凋亡的原位檢測。共聚焦顯微鏡觀察，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈深淺不一的綠色。每張切片于凋亡細胞分布區(qū)域隨機取5個高倍視野，計算平均每個視野中的凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比(%)，以凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)表示。

4.5心肌病理學(xué)觀察 采用HE染色，將心肌組織樣本固定于4% 甲醛1周后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度3 μm，脫蠟至水，Harris蘇木素染核，70%鹽酸乙醇分化，1%乙醇伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡觀察并攝像。

4.6Western blotting分析 按文獻報道方法[10]，提取心肌組織總蛋白，Bradford法蛋白定量后，-80 ℃保存。取上述蛋白提取液上清 (含蛋白150 μg) 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，12%分離膠)。將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 (nitrocellulose, NC)膜。5% BSA封閉40 min后分別加入Bcl-2、Bax、CRT、GRP78和caspase-12多克隆抗體(均為1∶500)和CHOP單克隆抗體 (1∶500) 4 ℃過夜孵育，1× TBS-T洗膜后，以相應(yīng)的II抗孵育1.5 h，并以GAPDH (1∶500) 單克隆抗體重復(fù)上述實驗過程，作為上樣對照。化學(xué)發(fā)光ECL顯示，采用Image-Pro Plus (Version 4.1) 軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值 (integrated absorbance，IA=A×面積)，以靶蛋白IA值/GAPDHIA值的比值反映靶蛋白水平。

5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(mean±SD) 表示，采用單因素方差分析 (One-way ANOVA) 進行多組間比較，采用q檢驗進行多組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1PQS對大鼠心肌I/R損傷的影響

1.1平均動脈壓和左室壓上升、下降最大速率 術(shù)中假手術(shù)組大鼠狀態(tài)良好，I/R組和PQS+I/R組分別死亡大鼠3只和4只，死亡原因包括感染、嚴重心律失常或麻醉致死。各組大鼠心率無顯著差異 (P>0.05)；與sham組比較，I/R組MAP 高55% (P<0.05)，左室(±dp/dtmax)分別低42%和43% (P<0.05)。PQS干預(yù)后可明顯改善I/R大鼠心功能，表現(xiàn)為PQS+I/R組MAP較I/R組低32% (P<0.05)，±dp/dtmax分別較I/R組高64%和35% (P<0.05),見表1。

表1 PQS對大鼠血流動力學(xué)的影響

I/R: ischemia/reperfusion; PQS:Panaxquinquefoliumsaponins.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

1.2PQS對血清cTnT含量的影響 I/R組血清cTnT含量較sham組顯著升高，為sham組的3.9倍(P<0.05)，PQS干預(yù)可明顯減少I/R大鼠血清cTnT的含量，PQS+I/R組血清cTnT含量較I/R組低53.3% (P<0.05),見圖1。

1.3PQS對大鼠心肌梗死面積的影響 伊文思藍和TTC雙染評價心梗面積，結(jié)果顯示,sham組大鼠無心肌梗死，sham組、I/R組和PQS+I/R組的缺血區(qū)面積分別為(49.8 ±3.4)%、(50.2±2.2)% 和(50.1±1.3)%，各組間無顯著差異(P>0.05)；I/R組AN/AAR百分比為(44.2±1.4)%，PQS明顯縮小心梗面積，PQS+I/R組AN/AAR百分比為(15.3±4.2)%，較I/R組降低65.5%(P<0.05),見圖2。

Figure 1. Effect of PQS on content of cTnT in serum.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖1PQS對血清cTnT含量的影響

Figure 2. Effect of PQS on myocardial infarct size in rats.I/R: ischemia/reperfusion; PQS:Panaxquinqueliumsaponins.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsI/R.

圖2PQS對心肌梗死面積的影響

1.4PQS對心肌細胞凋亡的影響 Sham組心肌細胞凋亡指數(shù)為(8.2±0.6)%，I/R可致心肌細胞凋亡顯著增加，I/R組心肌細胞凋亡指數(shù)為(56.9±6.0)%，是sham組的7.0倍(P<0.05)，PQS可顯著減輕I/R所致的心肌細胞凋亡，PQS+I/R組心肌細胞凋亡指數(shù)為(25.7±5.1)%，較I/R組低54.9% (P<0.05),見圖3。

1.5心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變 光鏡檢查結(jié)果顯示，sham組心肌組織形態(tài)學(xué)無明顯改變，肌纖維完整，排列規(guī)則；I/R組心肌纖維排列不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂，局部橫紋消失，呈斷裂、壞死融合；PQS+I/R組病理變化程度較I/R組減輕，未見明顯的心肌纖維斷裂、溶解、壞死,見圖4。

1.6凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax蛋白的表達 結(jié)果顯示,與sham組比較，I/R組Bcl-2蛋白表達低54.9%(P<0.05)，Bax蛋白表達是sham組的3.9倍(P<0.05)。PQS可顯著誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，PQS+I/R組Bcl-2蛋白表達是I/R組的2.1倍 (P<0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax的表達，Bax蛋白表達較I/R組低47.8% (P<0.05),見圖5。

2PQS對I/R心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子蛋白表達的影響

2.1GRP78和CRT蛋白的表達 結(jié)果顯示,I/R可明顯誘導(dǎo)GRP78和CRT蛋白的表達，與sham組比較，I/R組GRP78、CRT蛋白表達水平顯著增加，分別為sham組的3.1倍和3.0倍(P<0.05)；PQS可抑制I/R誘導(dǎo)的CRT過表達，較I/R組低43.4% (P<0.05),見圖6。

2.2CHOP蛋白表達的變化和caspase-12的活化 I/R可明顯誘導(dǎo)CHOP蛋白表達，為sham組的3.4倍(P<0.05)。PQS抑制I/R誘導(dǎo)的CHOP 蛋白表達，較I/R組降低38.6% (P<0.05),見圖7。

采用可同時識別caspase-12酶原 (pro-caspase-12，分子量約48～50 kD) 和剪切后的caspase-12 (cleaved caspase-12，分子量為36 kD) 的特異性抗體，進行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示,I/R可明顯誘導(dǎo)caspase-12蛋白剪切活化，剪切后的caspase-12的蛋白表達是sham組的2.5倍(P<0.05)；PQS抑制I/R后caspase-12 蛋白活化，PQS+I/R組剪切后caspase-12蛋白表達較I/R組降低23.7% (P<0.05),見圖7。

討 論

冠脈結(jié)扎法建立大鼠心肌I/R損傷模型，為目前評價藥物心肌缺血保護最常用的模型之一。因?qū)嶒灤笫笃废导冋⒔M間差異小、冠脈側(cè)枝循環(huán)少、易結(jié)扎、操作簡單等特點，成為首選I/R動物模型。本研究采用SD大鼠， 建立I/R損傷模型，肉眼觀察可見模型組左室前壁心肌顏色變淡甚至蒼白，而假手術(shù)組無明顯改變。心肌組織病理學(xué)染色與心梗面積測定既是反映組織損傷最直觀的指標，亦是反映藥物治療缺血性損傷有效性的客觀證據(jù)。本實驗采用心肌組織病理HE染色觀察心肌組織病理變化，結(jié)果顯示模型組細胞核固縮，間質(zhì)水腫，心肌纖維排列紊亂、斷裂；假手術(shù)組未見明顯改變； PQS組心肌組織病理變化程度較I/R組減輕。采用伊文思藍、TTC雙染評價心梗面積，結(jié)果顯示各組缺血區(qū)無顯著差異，說明各組結(jié)扎部位一致，不存在因結(jié)扎部位的不同而造成的人為誤差；模型組心梗面積較假手術(shù)組明顯增加，PQS可顯著減少I/R導(dǎo)致的心梗面積；平均動脈壓是一個心動周期中持續(xù)地推動血液向前流動的平均推動力，更精確地反映心臟和血管的機能狀態(tài)，每一心動周期由于舒張期時程長于收縮期，故平均動脈壓不是收縮壓與舒張壓的平均數(shù)，而是更靠近于舒張壓，平均動脈壓升高說明血管壁彈性減少，順應(yīng)性下降。本研究發(fā)現(xiàn)模型組平均動脈壓較假手術(shù)組明顯升高，反映左室舒張及收縮功能的±dp/dtmax顯著降低， PQS能顯著降低I/R引起的平均動脈壓升高，增加左室±dp/dtmax；心肌損傷標志物cTnT是目前診斷心肌損傷的特異性標志物，心肌急性缺血(氧)時，細胞膜損傷，通透性增加，cTnT大量漏出。本研究發(fā)現(xiàn)缺血45 min、再灌注24 h后，血清cTnT含量明顯增加。與模型組相比，PQS組血清nTnT顯著減少。以上均提示PQS可保護I/R心肌損傷，表現(xiàn)為減輕心肌壞死、改善心功能、減輕心肌細胞膜損傷等。

Figure 3. Effect of PQS on cardiomyocyte apoptotic index.Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖3PQS對大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響

Figure 4. Morphological changes of rat myocardial tissues (×200). A:sham group; B:ischemia/reperfusion group; C: pretreatment withPanaxquinqueliumsaponins group.

圖4大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變

Figure 5.Panaxquinquefoliumsaponins (PQS) reduced the expression of pro-apoptotic protein Bax and increased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖5PQS對I/R心肌Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Figure 6. Effect ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) on the expression of GRP78 and CRT in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖6PQS對I/R心肌GRP78和CRT蛋白表達的影響

Figure 7. Effect ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) on the expression of the ERS-associated apoptotic protein CHOP and activation of the apoptotic effector enzyme caspase-12 in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖7PQS對I/R心肌CHOP蛋白表達及caspase-12活化的影響

細胞凋亡是心肌I/R損傷的一個重要特征，在心肌I/R損傷過程中發(fā)揮重要作用[11]。Gottlieb等[12]利用家兔離體心臟灌流模型首次發(fā)現(xiàn)I/R中存在心肌細胞凋亡。Musat-Marcu等[13]研究發(fā)現(xiàn)離體灌流大鼠心臟再灌注早期即可發(fā)生心肌細胞凋亡。TUNEL法測心肌細胞凋亡，既可定性又可定量，可準確定位，且靈敏度高。本研究利用此方法發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組心肌細胞凋亡指數(shù)顯著增加，PQS可顯著降低I/R引起的細胞凋亡，提示PQS可通過抑制I/R心肌細胞凋亡，減輕心肌I/R損傷。抗凋亡基因bcl-2與促凋亡基因bax參與心肌I/R損傷細胞凋亡的調(diào)控[14-16]，抑制細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，是促進心肌I/R損傷后心功能恢復(fù)和減輕心肌致死性損傷的一條重要途徑。本研究采用Western blotting，檢測凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)模型組促凋亡因子Bax蛋白表達較假手術(shù)組顯著升高，抗凋亡因子Bcl-2的表達明顯降低，PQS可明顯降低I/R誘導(dǎo)的Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達。提示PQS可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子的表達，調(diào)控心肌細胞凋亡過程，減輕心肌損傷。

I/R發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)是氧自由基產(chǎn)生和鈣超載。ER是調(diào)節(jié)Ca2+和蛋白質(zhì)合成的重要場所，ER理化環(huán)境改變和ER過負荷等因素導(dǎo)致的ERS在I/R損傷的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義[17]。GRP78為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志分子，早期ERS時GRP78與ER內(nèi)誤折疊及未折疊蛋白結(jié)合，減輕ER負荷，恢復(fù)其穩(wěn)態(tài)。因此，GRP78的表達標志ERS的發(fā)生。Shibata等[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦缺血1 h后GRP78表達升高；Flores-Diaz等[19]報道，心肌缺血/缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、CRT表達上調(diào)。本研究采用Western blotting方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)各處理組GRP78的蛋白表達均明顯高于假手術(shù)組，提示I/R誘發(fā)了ERS，與文獻[20]報道一致。PQS通過調(diào)節(jié)ERS，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而增加心肌抗I/R損傷的能力；CRT是ER中主要鈣結(jié)合伴侶蛋白，在維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)，協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊及調(diào)節(jié)細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。Ihara等[21]利用H9c2成心肌細胞研究證實高表達的CRT可促進細胞凋亡。本研究亦發(fā)現(xiàn)I/R誘導(dǎo)CRT蛋白表達水平顯著升高，與文獻報道一致[22]。PQS可減輕I/R誘導(dǎo)的CRT過表達，表明PQS可通過調(diào)節(jié)CRT蛋白表達，減少I/R引起的細胞凋亡。

I/R誘導(dǎo)細胞凋亡，除經(jīng)典的死亡受體途徑和線粒體途徑外，ERS相關(guān)凋亡途徑引起廣泛關(guān)注[23-26]。持續(xù)或嚴重的ERS通過激活凋亡信號分子 CHOP、caspase-12和JNK啟動ERS相關(guān)凋亡途徑，誘導(dǎo)細胞凋亡。CHOP又稱生長停滯及DNA損傷誘導(dǎo)蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153, GADD153)，是CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，為ERS相關(guān)凋亡途徑的特異性標志物。嚴重ERS時，CHOP通過直接調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因，增加細胞對ERS介導(dǎo)凋亡的敏感性[27]。研究表明，缺血/缺氧可誘導(dǎo)CHOP表達顯著增加，破壞了Bcl-2家族促凋亡與抗凋亡基因之間的平衡，促進細胞凋亡[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，I/R顯著誘導(dǎo)了CHOP蛋白表達，PQS可顯著抑制I/R誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達，提示PQS可能通過抑制過度ERS介導(dǎo)的細胞凋亡起到心肌保護作用。Caspase-12定位于ER外膜，以無活性的酶原形式存在，是ERS相關(guān)凋亡途徑的特異性分子，持續(xù)或嚴重的ERS引起caspase-12激活，活化的caspase-12進一步激活casepase-9，接著激活caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R可明顯誘導(dǎo)剪切后caspase-12的蛋白表達，提示ERS相關(guān)凋亡途徑在I/R損傷中具有重要作用，與文獻[22]報道一致。PQS可顯著抑制I/R誘導(dǎo)的caspase-12活化， PQS抑制I/R引起的細胞凋亡也與其抑制caspase-12活化有關(guān)。

綜上所述，PQS具有抗大鼠心肌I/R損傷的作用，其機制可能通過抑制過度ERS引起的細胞凋亡有關(guān)，表現(xiàn)為降低I/R誘導(dǎo)的CRT過表達，抑制CHOP、caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路激活，其下游信號通路有待進一步探索。

[1] 曹 霞，谷欣權(quán)，陳燕萍，等.西洋參莖葉三醇組皂甙對缺血再灌注損傷心肌的保護作用[J]. 中國老年學(xué)雜志,2004,7(24):654-655.

[2] 殷惠軍，張 穎，蔣躍絨，等.西洋參葉總皂甙對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(3):232-235.

[3] 關(guān)利新，衣 欣，楊世杰，等.西洋參莖葉皂甙對大鼠心肌細胞Ca2+內(nèi)流的影響[J].中國藥理與臨床,2004,20(6):8-9.

[4] 鞠傳靜，張志國，趙學(xué)忠，等.西洋參葉二醇組皂甙對大鼠實驗性心室重構(gòu)的保護作用[J].中國老年學(xué)雜志,2007,27(22):2173-2175.

[5] Boya P, Cohen I, Zamzami N, et al. Endoplasmic reticulum stress-induced cell death requires mitochondrial membrane permeabilization [J]. Cell Death Differ, 2002, 9(4):465-467.

[6] Breckenridge DG, Germain M, Mathai JP, et al. Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways [J]. Oncogene, 2003, 22(53): 8608-8618.

[7] Wang C, Li YZ, Wang XR, et al.Panaxquinquefoliumsaponins reduce myocardial hypoxia/reoxygenation injury by inhibiting excessive endoplasmic reticulum stress [J]. Shock, 2012, 37(2): 228-233.

[8] 趙秀梅，孫 勝，劉秀華. 墊扎球囊法復(fù)制大鼠在體心肌缺血/再灌注模型[J].中國微循環(huán), 2007, 11(3): 206-208.

[9] Liu XH，Grund F，Kanellopoulos GK，et al. Myocardial extracellular signal regulatory kinases are activated by laser treatment [J]. J Cardiovasc Surg (Torino), 2003, 44(1):1-7.

[10]Xu FF, Liu XH, Cai LR. Role of hypoxia-inducible factor-1α in the prevention of cardiomyocyte injury induced by hypoxic preconditioning[J]. Acta Physiol Sin, 2004, 56(5): 609-614.

[11]Zhao ZQ, Vinten-Johansen J. Myocardial apoptosis and ischemic preconditioning[J]. Cardiovasc Res, 2002, 55(3): 438-455.

[12]Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA, et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes[J]. J Clin Invest, 1994, 94(10): 1621-1628.

[13]Musat-Marcu S, Gunter HE, Jugdutt BI, et al. Inhibition of apoptosis after ischemia-reperfusion in rat myocardium by cycloheximide [J]. J Mol Cell Cardiol, 1999, 31(5): 1073-1082.

[14]Fliss H, Gattiuger D. Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium [J]. Circ Res, 1996, 79(5): 949-956.

[15]Borutaite V, Brown GC. Mitochondria in apoptosis of ischemic heart [J]. FEBS Lett, 2003, 541(1-3): 1-5.

[16]姚 震, 焦解歌, 馮建章. 心肌缺血再灌注損傷與細胞凋亡關(guān)系的實驗研究[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2000, 6(3): 129-133.

[17]Vilatoba M, Eckstein C, Bilbao G, et al. Sodium 4-phenylbutyrate protects against liver ischemia reperfusion injury by inhibition of endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis [J]. Surgery, 2005, 138(2):342-351.

[18]Shibata M,Hattori H, Sasaki T, et al. Activation of caspase-12 by endoplasmic reticulum stress induced by transient middle cerebral artery occlusion in mice [J]. Neuroscience, 2003, 118(2):491-499.

[19]Flores-Diaz M, Higuita JC, Florin I, et al. A cellular UDP-glucose deficiency causes overexpression of glucose oxygen-regulated proteins independent of endoplasmic reticulum stress elements [J]. J Biol Chem, 2004, 279(21): 21724-21731.

[20]Szegezdi E, Duffy A, O’Mahoney ME, et al. ER stress contributes to ischemia-induced cardiomyocyte apoptosis [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 349(4): 1406-1411.

[21]Ihara Y, Urata Y, Goto S, et al. Role of calreticulin in the sensitivity of myocardiac H9c2 cells to oxidative stress caused by hydrogen peroxide[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2006, 290(1): C208-C221.

[22]Liu XH, Zhang ZY, Sun S, et al. Ischemic postconditioning protects myocardium from ischemia/reperfusion injury through attenuation endoplasmic reticulum stress [J]. Shock, 2008, 30(4): 422-427.

[23]Hayashi T, Saito A, Okuno S, et al. Damage to the endoplasmic reticulum and activation of apoptotic machinery by oxidative stress in ischemic neurons[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2005, 25(1): 41-53.

[24]Matindale JJ, Fernandez R, Thuerauf D, et al. Endoplasmic reticulum stress gene induction and protection from ischemia/reperfusion injury in the hearts of transgenic mice with a tamoxifen-regulated from of ATF6 [J]. Circ Res, 2006, 98(9): 1186-1193.

[25]王 琛,李玉珍,王曉礽,等.西洋參莖葉總皂苷通過抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷[J].中國病理生理雜志,2012,28(1):22-28.

[26]劉 穎，紀 超，吳偉康.附子多糖保護缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細胞及其抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制研究[J].中國病理生理雜志,2012,28(3):459-463.

[27]Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Death Differ,2004,11(4): 381-389.

[28]McCullough KD, Martindale JL, Klotz LO, et al. Gadd153 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl-2 and perturbing the cellular redox state[J]. Mol Cell Biol,2001, 21(4):1249-1259.

[29]Szegezdi E, Fitzgerald U, Samali A. Caspase-12 and ER-stress-mediated apoptosis: the story so far [J]. Ann N Y Acad Sci, 2003, 1010 : 186-194.

[30]Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, et al. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-β [J]. Nature, 2000, 403(6765):98-103.

Panaxquinquefoliumsaponinsprotectratmyocardiumfromischemia/reperfusioninjurythroughattenuatingexcessiveendoplasmicreticulumstress

WANG Chen1,2, LIU Mi2, SUN Sheng3, SONG Dan-dan3, LIU Xiu-hua3, SHI Da-zhuo2

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,3DepartmentofPathophysiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;2XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China.E-mail:xiuhualiu98@yahoo.com.cn;shidz666@sohu.com)

AIM: To investigate whether excessive endoplasmic reticulum stress (ERS) is involved in the protective mechanism ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) against ischemia/reperfusion (I/R) injury in rat myocardium.METHODSThe model of myocardial I/R injuryinvivowas made by ligating the left anterior descending artery for 45 min followed by 24 h of reperfusion in SD rats. The hemodynamics and serum content of cardiac troponin T (cTnT) were measured. The myocardial infarct size was measured by Evans blue and 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Cardiomyocyte apoptosis was detected usinginsituTDT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The protein levels of glucose-regulated protein 78 (GRP78), calreticulin (CRT), C/EBP homologous protein (CHOP), caspase-12, apoptosis-associated proteins Bax and Bcl-2 were determined by Western blotting.RESULTSCompared with I/R group, the mean arterial pressure in PQR+IR group was decreased by 32.0%, and left ventricular±dp/dtmaxwas increased by 64.0% and 35.0%， respectively.The serum content of cTnT was decreased by 53.3%, the percentage of area of necrosis (AN)/area at risk (AAR) was reduced by 65.5% and the apoptosis rate was decreased by 54.9%.The myocardial pathological changes were improved. Bcl-2 protein expression was increased by 110.0% and that of Bax was decreased by 47.8%. CRT protein expression was decreased by 43.4 %, CHOP protein expression and the protein level of cleaved caspase-12 were decreased by 38.6% and 23.7% in PQS+I/R group.CONCLUSIONPQS alleviates I/R injury in myocardium by inhibition of excessive ERS.

Panaxquinquefoliumsaponins; Ischemia/reperfusion; Endoplasmic reticulum stress

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.004

1000- 4718(2013)01- 0020- 08

2012- 08- 20

2012- 11- 21

科學(xué)技術(shù)部國際科技合作項目資助課題(No.2010DFA31690)

△通訊作者 劉秀華 Tel：010-66939774； E-mail: xiuhualiu98@yahoo.com.cn； 史大卓 Tel： 010-62860499； E-mail: shidz666@sohu.com