高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣片的溶出度

范松華

（上海市醫藥學校 上海 200135）

阿托伐他汀鈣（atorvastatin calcium）是羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑。臨床用于高膽固醇血癥，混合型高脂血癥，雜合子高膽固醇血癥及混合型高脂血癥的治療。由美國華納公司開發，1996 年12月獲得FDA 批準，目前由輝瑞公司生產銷售，商品名“立普妥”[1]。

我國于2000年批準進口立普妥，至今國內已有多個企業獲得仿制藥物的生產許可，同時還有包括國外仿制藥企業在內的多個生產商提出了上市許可。

目前，國內外均批準了不同晶型的阿托伐他汀鈣制劑上市應用。在口服固體制劑的研制中，通過溶出曲線，可直觀反映藥物的體外釋放速度和程度。借助溶出曲線評價體系，可指導處方篩選，避免研制工作的盲目性，還可提高體內生物等效性試驗的成功率[2]。因此在仿制藥研制過程中，對溶出曲線的評價日益受到各國藥監部門的關注與重視。

參考阿托伐他汀鈣片國家藥品標準[3-4]溶出度測定方法，目前采用的的方法為紫外分光光度法。溶出度檢查條件和限度一致(900 ml水，50 r/min，30 min的限度為80%)。紫外分光光度法的專屬性差，可能受到輔料(如可能對不同規格的制劑使用不同顏色的薄膜衣著色劑)的干擾，并且不能區分可能存在的降解產物。美國藥典35版中收載了HPLC法測定阿托伐他汀鈣含量的分析方法[5]，但一份樣品時間長達2 h，不適合進行批量樣品的溶出度分析。本文的目的是研究建立一種高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣片劑的分析方法，達到快速、準確、專屬性高的目的。

1 儀器與試藥

RC-6D藥物溶出儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)，Waters Alliance高效液相色譜儀(沃特世公司，包括2695分離單元和2998二極管陣列檢測器)，AB265S電子天平(梅特勒-托利多公司)，KQ-7000DV超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)，TGL-16G臺式離心機(上海菲洽爾儀器有限公司)。

乙腈(色譜純，Merck 61830025001730)、甲醇(色譜純，Merck 1.06007)、磷酸(色譜純，Honeywell，66129)，整體化色譜柱Chromolith Performance RP-18e 100-4.6(Merck)，水為Mill-Q超純水。

原研阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，批號111010K)購自藥店，自制阿托伐他汀鈣片由本校制劑室制備，阿托伐他汀鈣對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：100590-200802，純度95.5%)。阿托伐他汀鈣雜質A(脫氟物)對照品購自美國藥典委員會，批號G0J255，含雜質A以游離堿計為92%；阿托伐他汀鈣雜質D(乙氧基物)對照品購自美國藥典委員會，批號G0J257，含相關物質D以游離堿計為86%。

2 方法

2.1 色譜條件

使用Merck Chromolith RP-18e整體化色譜柱(100 mm×4.6 mm)，乙腈-0.1%磷酸以2.0 ml/min的流速進行梯度洗脫：0～2 min，乙腈比例為35%；2～6 min，乙腈比例自35%線性變化至90%；6.1～8 min，保持乙腈比例為35%再次平衡；檢測波長244 nm；柱溫為室溫，進樣體積20 μl。每份樣品的分析時間為8 min。

2.2 專屬性

進行了3項實驗以驗證分析方法的專屬性，以二極管陣列檢測器記錄的三維色譜圖，通過色譜工作站的峰純度判斷阿托伐他汀鈣峰是否存在干擾。

取空白輔料約20 mg，加溶出介質500 ml，超聲(250 W，40 kHz) 30 min，冷卻后離心分離上清液，照2.1中的色譜條件進樣測定，空白介質和輔料對阿托伐他汀鈣色譜峰(約4.7 min)沒有干擾（圖1）。

圖1 空白介質(A)，空白輔料(B)和相當于90%溶出率的對照品溶液(C)的色譜圖

分別取阿托伐他汀鈣對照品，阿托伐他汀鈣雜質A對照品和雜質D對照品，用甲醇制成含阿托伐他汀鈣約20 μg/ml，含雜質A和雜質D各約0.4 μg/ml的混合溶液，照2.1中的色譜條件進樣20 μl，雜質A和雜質D對阿托伐他汀鈣色譜峰(約4.7 min)沒有干擾（圖2）。

A：雜質A與雜質雜質D分別為20 μg/ml，B：阿托伐他汀鈣和雜質A、雜質D的混合色譜圖雜質A的保留時間約為4.59 min，阿托伐他汀的保留時間約為4.68 min，雜質D的保留時間約為5.42～5.77 min圖2 雜質對照品與阿托伐他汀分離的色譜圖

取阿托伐他汀鈣的甲醇溶液(1 mg/ml)，分別用0.1 mol/L氫氧化鈉、0.1 mol/L鹽酸和30%過氧化氫溶液稀釋1倍；另取部分水溶液，分別在85℃水浴中放置8 h和10 000 Lux照度下強光照射24 h，照2.1中的色譜條件進樣20 μl，可見阿托伐他汀鈣在強酸、氧化劑和強光照射下出現明顯的降解，降解產物對阿托伐他汀鈣色譜峰(約4.7 min)沒有干擾（圖3）。

A：酸降解；B：氧化劑降解；C：加熱水解；D：強光照射圖3 苛刻條件下的降解產物分離的色譜圖

酸水解和加熱水解產物的保留時間分別約為5.08 min和5.52 min，氧化產物約在2.52 min和3.04 min，光照降解產物在約7.68 min洗脫。

專屬性實驗的結果顯示，在選定的色譜條件下，空白輔料和主要的已知降解雜質（脫氟物雜質A和乙氧基物雜質D）均對阿托伐他汀鈣的測定沒有干擾；阿托伐他汀鈣在強酸、氧化劑和高溫條件下的降解產物對阿托伐他汀鈣的測定也沒有干擾。

2.3 標準曲線

在相當于標示量10%～400%溶出率的范圍（約0.9～40 μg/ml）內進行了7個濃度水平的線性范圍考察。以濃度C (μg/ml)～峰面積繪圖，通過相關系數(r)、Y軸截距(b相當于最低濃度峰面積的百分比)和殘差圖進行評價，結果顯示，采用高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣片溶出液，在相當于標示濃度10%～400%的范圍內呈現典型的線性關系，回歸方程Y(峰面積)=25 549XC-1 368，相關系數r=0.999 998 (n=7)， Y軸截距相當于最低濃度峰面積的5%，各數據點的殘差為典型的離散分布。驗證了使用HPLC法測定阿托伐他汀鈣，響應值與濃度之間為線性關系。

2.4 檢測限和定量限

取相當于10%溶出率的標準溶液(約0.944 μg/ml )連續進樣6次，峰面積的相對標準偏差為0.5%，可以達到穩定積分。取相當于10%溶出率的標準溶液用水稀釋20倍后再次進樣，積分面積1 108，峰高約相當于基線噪音的3倍，即最小檢測限約為標示量的0.5%。

2.5 回收率

在約 70 μg/ml、90 μg/ml和 11 μg/ml 3 個濃度水平 (以標示量計，分別相當于溶出率的60%、80%和100%)進行了基于空白輔料的模擬溶出回收率實驗，對照品和空白輔料加入溶劑(溶劑是以重量法定量加入的)后超聲30 min，冷卻后離心處理，外標法測定加入量。表1給出了3個濃度水平各3份溶液的測定結果。

2.6 精密度

溶出度檢查的測定對象是單位制劑，而制劑單元之間的含量差異限度遠大于分析方法的誤差，因而精密度的考察是以同一分析批內的對照品溶液重復進樣而測定的。此外，在溶出曲線的測定結果中，20 min后(平均溶出率超過90% )的同批次片劑，溶出度測定結果間的差 ≤5%。顯示HPLC法的精密度可以滿足測定的要求（表2）。

表1 三個濃度水平的回收率實驗

表2 不同分析批中對照品溶液進樣的精密度

2.7 溶出液的穩定性

考慮到溶出度的測定中，采用選定的色譜條件，單一樣品的分析時間很短，一個批次樣品的溶出度可在數小時內完成，溶出曲線分析也可以在一個工作日內完成，因而僅在研究的早期進行了24 h內溶出液穩定性的考察（表3）(樣品在室溫環境下密封放置于自動進樣器托架上)。

表3 溶出液的穩定性

供試品的溶出液在室溫條件下均可穩定放置至少24 h。

2.8 濾膜吸附驗證

在研究中，制備了模擬的溶出度溶液，將3個片劑分別置入3個裝有900 ml水的三角瓶中超聲處理，取部分模擬溶出液，一半進行離心處理，另一半使用13 mm的0.45 μm水系濾膜(PES)進行3次順序過濾，棄去0.5 ml初濾液后收集后3次濾液，每次1.0 ml，將3次的濾液和離心后的上清液分別采用USP 35版分析方法中的色譜條件進樣測定。在3次實驗中，9份濾液的峰面積與離心液的峰面積比值均在99.0%～102.0%之間，可以認為PES濾器對阿托伐他汀鈣的溶出液不存在吸附，溶出液可以采用PES濾器過濾的方法處理。

3 測定結果

參照阿托伐他汀鈣國家標準溶出度測定方法和中國藥典2010年版二部溶出度測定方法[6]，進行溶出曲線的測定。分別考察了在水、0.1 mol/L鹽酸溶液，pH 4.5和pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出曲線。

在槳法每種介質的實驗中，介質體積900 ml，介質溫度37.5 ℃，轉速5 r/min。測定前經過煮沸脫氣，待恒溫后投入片劑，自片劑接觸溶劑時開始計時；分別在第5、10、15、20、30、45 min時停止轉槳，從每個溶出杯中分別吸取溶液2 ml，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為供試品溶液。

精密稱取阿托伐他汀鈣對照品約25 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度；精密量取1.0 ml，置100 ml量瓶中，分別用相應的溶出介質稀釋至刻度，作為對照品溶液。

按照阿托伐他汀鈣國家標準溶出度測定方法[3]，分別取供試品溶液和對照品溶液，在241 nm的波長處測定吸收度，計算每片的溶出量。另取部分溶出液，照2.1中的色譜條件進樣，以阿托伐他汀峰的峰面積外標法計算每片的溶出量。表4是分別采用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定的自制片劑溶出曲線數據。

表4 HPLC法和UV法測定同批次樣品的結果對比

HPLC法得到的結果與紫外分光光度法相當，而15 min后的測定結果離散最小，顯示了更高的精密度。

圖4是采用高效液相色譜法測定的原研片劑和自制片劑在水、pH 4.5或pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出曲線。

A B C A：水；B：pH 6.8磷酸緩沖液；C：pH 4.5磷酸緩沖液圖4 原研片劑（對照）和自制片劑的溶出曲線

4 討論

新開發的高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣片溶出度的分析方法通過了方法學驗證。相比于現行國家標準中的紫外分光光度法，具有更高的專屬性，這體現為HPLC法可以分離潛在的降解產物，并且得到精密度更高的測定結果。

自制的阿托伐他汀鈣片和原研品在水(質控介質)、pH 4.5或pH 6.8緩沖液中，具有相同的體外釋放特征，經比較具有相似的體外溶出曲線[7]。

阿托伐他汀在鹽酸中迅速分解，產生至少兩個主要的降解產物，HPLC法可以良好的分離雜質和活性成分。

研究結果顯示，HPLC法具有比紫外分光光度法更高的專屬性、靈敏度、準確度和精密度，可以排除輔料(如不同顏色的包衣層)和潛在的降解產物對阿托伐他汀鈣口服制劑溶出度測定的干擾，適用于進行溶出曲線、溶出度的質控和不同處方產品的質量評價。

[1] 李健齋, 傅得興. 高效他汀類降血脂新藥阿托他汀[J]. 中國新藥雜志, 1999, 8 (5 ): 294-298.

[2] 謝沐風, 張啟明, 陳潔, 等. 國外藥政部門采用溶出曲線評價口服固體制劑內在品質情況簡介[J]. 中國藥事, 2008,22 (3): 257-261.

[3] 國家藥典委員會. 國家藥品監督管理局國家藥品標準[M].北京: 化學工業出版社, 2004(36): 102-103.

[4] 國家藥典委員會. 國家藥品監督管理局進口藥品注冊標準[M]. 北京: 國家藥品監督管理局印制, 2000: 343-344.

[5] United States Pharmacopeial Convention. USP35-NF30[M].Rockville: United States Pharmacopeia, 2012: 2263-2265.

[6] 國家藥典委員會. 中國藥典2010年版二部[M]. 北京：中國醫藥科技出版社, 2010: 附錄85-附錄87.

[7] 謝沐風. 溶出曲線相似性的評價方法[J]. 中國醫藥工業雜志, 2009, 40 (4): 308-311.