Pim-1激酶小分子抑制劑的研究進展

孫占莉 肖旭華 袁博

（中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院 上海 200437）

原癌基因pim-1是基因pim家族（現發現的有pim-1、pim-2、pim-3）中的一員，最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMuLV)的前病毒插入點被發現[1]，其編碼的Pim-1激酶屬于鈣/鈣調蛋白調節激酶(calcium/calmodulin-regulated kinase，CAMK)，在多細胞組織的進化過程中高度保守。pim-2和pim-3是pim家族的另外兩個成員，他們與pim-1分別具有55%和65%的同源性。

pim-1在調控細胞凋亡，分化，增殖以及腫瘤形成等方面發揮了非常重要的作用。Pim-1激酶能通過一個保守的甘氨酸環狀基序磷酸化眾多的在細胞凋亡、細胞周期調控中起重要作用的細胞因子，包括c-Myc，BAD，Socs1，Cdc25A，HP1，PAP-1，p21cip1/waf1，PTP-U2S，NFATc1等，從而導致腫瘤發生[2]。Pim-1對FLT3-ITD AML具有上調作用，其抑制劑AR00459339可以促進FLT3下游靶點STAT5，AKT，BAD的去磷酸化，對FLT3-ITD細胞如MV-4-11，Molm-14，和TF/ITD細胞系以及FLT3-ITD主要樣品具有細胞毒性[3]。Pim-1通過直接磷酸化Cdc25C推進細胞周期G2/M的進程，促進細胞的增殖分化[4]。Pim-1還可通過與Socs1和Socs3抑制因子聯合作用發揮其潛在的STAT5轉錄抑制作用。Pim-1能夠與NFATcl轉錄因子結合并使其絲氨酸片段磷酸化，促進IL-2的生成，啟動IL-2依賴的淋巴細胞的增殖和成熟[5]。最近研究表明Pim-1激酶在免疫調節、炎癥（炎性腸疾病）以及新陳代謝和細胞增長中起著一定的作用[6-7]。通過抑制Pim-1激酶，還可以增強Runx3的表達和阻止TH2及TH17 T細胞變異，從而預防花生過敏[8]。

在癌細胞，如白血病，淋巴瘤，以及前列腺癌中過表達Pim-1具有致命作用[9]，而在正常細胞中沒有。因此，與傳統的化學治療方法相比，抑制Pim-1激酶不會有有害的副反應。多種特異性和潛在的Pim-1激酶抑制劑也已經表現出誘導癌細胞凋亡，增加癌細胞對化療的敏感性以及協同其他抗癌藥物作用，如抑制Pim激酶可以增強蘇尼替尼對腎細胞癌的活性[10]，Pim-1作用于Akt下游，可以調解地氟烷誘導和心肌缺血后適應性，增加心肌細胞存活[11]。Pim-1抑制劑ETP-45299與PI3K抑制劑GDC-0941合并使用，對MV-4-11 AML細胞有很強的協同作用[12]，與Bcl-2家族的小分子抑制劑ABT-737聯合使用，體內和體外均引起前列腺癌細胞顯著凋亡[13]。因此，Pim-1激酶是一個很有前景的治療靶點。

1 Pim-1的結構特點

在典型的絲/蘇氨酸或蘇氨酸激酶中，ATP和鉸鏈區形成兩個氫鍵：一個是嘌呤的NH2作為供體與鉸鏈的羰基形成氫鍵，另一個是受體在嘌呤N-1和激酶的骨架NH之間聯系。在Pim家族中這個殘基是脯氨酸，因此同樣的氫鍵相互作用不存在（圖1）[14-15]。由于鉸鏈區脯氨酸殘基Pro123的存在，Pim-1激酶區域僅通過一個氫鍵結合天然底物ATP。脯氨酸的存在使Pim-1與其他的激酶顯著不同[16]。這個鉸鏈區域是由Leu120，Glu121，Arg122和Pro123構成[9,17]，Pim-1結構另一個重要區域是富含谷氨酸磷酸鹽結合彎曲部分（P-loop），包含氨基酸殘基：Gly45，Ser46，Gly47，Gly48，Phe49和Gly50。嵌入物和脯氨酸共同引起了鉸鏈區的擴張并形成了更大的空間，以便抑制劑占領并發揮作用。

2 作用于Pim-1的小分子抑制劑

圖1 Pim-1鉸鏈區和P-loop

近年來報道的有關Pim-1小分子抑制劑結構種類很多[9,17-22]。包括黃酮類、咪唑并[1,2-b]噠嗪、吡唑并[1,5-a]嘧啶和3-芳基-6-氨基-三唑并[4,3-b]噠嗪、苯亞甲基-噻唑烷-2,4-二酮、吡咯并[2,3-a]咔唑、苯并呋喃-2-羧酸類、取代的吡唑酮類、高效有機釕衍生物（III）等。黃酮類也抑制其他幾種激酶，使得這些化合物作為Pim-1抑制劑的用途不是很清楚。咪唑并[1,2-b]-和三氮唑并[4,3-b]-哌嗪（II）是一種高效選擇性Pim-1抑制劑，在納摩爾濃度就有抑制活性[22-23]。此外，異噁唑并[3,4-b]喹啉酮及其類似物是一類在納摩爾濃度就有效的高選擇性的新型Pim-1和Pim-2抑制劑。

2.1 吲哚咔唑和二吲哚順丁烯二酰亞胺衍生物

一些吲哚咔唑和二吲哚順丁烯二酰亞胺衍生物具蛋白激酶抑制活性，研究發現星孢菌素和結構相關的二吲哚順丁烯二酰亞胺類化合物1，2和3（圖2）在1μmol/L時可產生90%的Pim-1抑制作用。這類化合物與Pim-1的結合特點表明，Pim-1鉸鏈骨架通過Glu121的羰基氧與順丁烯二酰亞胺的NH形成氫鍵作用，而Pro123的存在使得鉸鏈區與順丁烯二酰亞胺羰基無其他的氫鍵作用。盡管化合物1沒有二面角構象，仍能很好的固定到ATP結合縫隙中，其吲哚部分被氨基酸殘基Leu44，Phe49，Val52，Ala6，Ile104，Leu120，Leu174和Ile185通過疏水接觸包裹，產生穩定的疏水作用力。

2.2 咪唑并[1,2-b]噠嗪類和吡唑并[1,5-a]嘧啶類

圖2 吲哚咔唑和二吲哚順丁烯二酰亞胺衍生物

Bullock等[14]首次報道咪唑并[1,2-b]噠嗪類化合物4-6（圖3）和吡唑并[1,5-a]嘧啶類化合物10（圖3B）在納摩爾濃度對Pim-1有抑制活性，且對Pim-1的選擇性是Pim-2的100倍[14]。化合物4具有抗白血病活性，X光衍射顯示化合物4結合到Pim-1的ATP結合位點上，Lys67的N-1位的氮原子參與氫鍵作用，抑制劑與殘基Leu44，Phe49，Ile104和Leu120之間有疏水穩定作用。化合物5誘導人白血病細胞系MV-4-11凋亡，減少Pim下游靶點的磷酸化；在體外可減少初期白血病的發生。咪唑并[1,2-b]噠嗪類（圖3A）被認為是ATP競爭性抑制劑而不是ATP類似物[1,24-25]。在各種咪唑并[1,2-b]噠嗪中化合物8和9（圖3A）活性較好。進一步構效關系研究發現R2疏水作用對選擇性和去溶劑化的影響不大，R1對活性影響較大。R1、R2結構優化獲得的化合物6對Pim-1的 IC50是39 nmol/L。

圖3 咪唑并[1,2-b]噠嗪類(A)和吡唑并[1,5-a]嘧啶類(B)

ETP-45299是一個有效的選擇性Pim-1抑制劑，能抑制Bad和4EBP1的磷酸化，阻止人細胞系中實體瘤和非實體瘤細胞的增殖。ETP-45299與PI3K抑制劑GDC-0941合并使用，對MV-4-11 AML細胞有很強的協同作用，這表明合并使用選擇性Pim激酶抑制與PI3K抑制劑可能會產生很好的臨床效益[12]。

SGI-1776是由SuperGen公司最初通過虛擬篩選得到的一個化合物，已進入I期臨床試驗。該化合物對Pim-1，Pim-2，Pim-3都具有較高的抑制作用，能夠誘導慢性淋巴細胞白血病細胞的凋亡；最近Hospital等[26]提出SGI-1776抗白血病的機制是直接抑制FLT3激酶在AML中的活性。SGI-1776還可以誘導前列腺癌細胞中的細胞周期停滯和凋亡，與雄性激素-依賴性細胞相比，在雄性非依賴細胞中具有顯著的細胞毒性效應。最重要的是SGI-1776可使對化療藥物耐藥的前列腺癌細胞系對紫杉醇再敏化。體內腫瘤模型實驗初步研究顯示SGI-1776具有治療效果[27]。

2.3 異噁唑并[3,4-b]喹啉-3,4（1H,9H）-二酮類

以異噁唑并[3,4-b]喹啉-3,4（1H,9H）-二酮為骨架的化合物，最初是由Abbott實驗室開發作為Pim-1抑制劑，其中化合物11（圖4A）在納摩爾濃度對Pim具有抑制活性，化合物12（圖4A）對Pim-1的抑制作用是IC50=2.5 nmol/L，是該類中最高效的Pim-1抑制劑。Abbott實驗室進一步研究得到的化合物13（圖4A）對Pim具有很高的抑制活性和選擇性（IC50=2.5 nmol/L）。研究以異噁唑并[3,4-b]喹啉-3,4-（1H,9H）-二酮為骨架作為潛在的Pim-1和Pim-2激酶抑制劑的構效關系表明，R2可以為多種烷基基團，R3只能是小基團，如質子，甲基，以維持分子的抑制活性[18]。

2.4 吡啶酮類衍生物

吡啶酮類衍生物是Valeant Pharmaceuticals R&D從160 000個化合物中篩選得到[19]，其中化合物14（圖4B）活性最高（IC50=50 nmol/L），這一類化合物與Pim-1的復合物X光-單晶衍射分析推測，該類化合物是ATP競爭性抑制劑。化合物14與鉸鏈區唯一有潛在相互作用的部位是R1苯環的左側，這個復雜的結構被定義為Glu121的主要羰基與R1芳香氫（C-3）的弱氫鍵作用（C=O…H-C）。Glu121的羰基與芳香族C-4的氫之間的氫鍵可能也有助于穩定化合物14與Pim-1的鉸鏈區。化合物14的結合可競爭性地抑制ATP的利用，從而抑制了Pim-1的功能[19]。

2.5 苯亞甲基-噻唑烷-2,4-二酮類[28]

5-苯基芐烯基噻唑-2,4-二酮類是一類新的Pim-1和Pim-2抑制劑[17]，IC50在納摩爾濃度范圍。這類化合物體外可以阻斷Pim磷酸化多肽和蛋白質，并抑制前列腺癌細胞和白血病細胞在細胞周期G1階段的生長。化合物15（圖5A）是從ChemBridge化合物庫中篩選獲得，對Pim-1和Pim-2的抑制作用分別是IC50=24 nmol/L和0.1μmol/L。化合物16（圖5A）對Pim-1的抑制作用稍強（IC50=13 nmol/L），而對Pim-2的抑制作用稍低（IC50=2.3μmol/L）。

圖4 異噁唑并[3,4-b]喹啉-3,4（1H,9H）-二酮類（A）和吡啶酮類衍生物（B）

2.6 3-芳基-6氨基-三唑并[4,3-b]噠嗪類[15]

X光-單晶衍射顯示化合物17（圖5B）與Pim-1結合方式與化合物4結合的方式不同，在化合物17與Pim-1結合的復合物中m-CF3-苯環通過兩部分氫鍵即芳香環C-5和C-6位上的質子與Glu121骨架羰基之間的氫鍵與鉸鏈區的Glu121連接。

化合物17雖然是有效的Pim-1選擇性抑制劑，但是其物理性質限制了其應用。以化合物17為先導化合物，R用哌啶基取代得到化合物18（圖5B），其溶解度得到改善（pH 7.4時溶解度大于200 μmol/L），而活性不變。

2.7 吡咯并[2,3-a]咔唑類

以吡咯并[2,3-a]咔唑為骨架的Pim抑制劑，C-6位被溴原子取代得到化合物19（圖5C），對Pim-1有很好的抑制作用（IC50=6.8 nmol/L）。C-6位溴原子與Glu121骨架羰基之間的排斥力可能是化合物19與Pim-1的一個額外相互作用力[28]。對吡咯并[2,3-a]咔唑C-3位改造，可合成新的Pim激酶的選擇性抑制劑（化合物20，21，22和23）。體外實驗測試表明，這類化合物均具有納摩爾濃度級的Pim激酶抑制活性。

圖5 苯亞甲基-噻唑烷-2,4-二酮類(A)，3-芳基-6氨基-三唑[4,3-b]噠嗪類（B）和吡咯并[2,3-a]咔唑類（C）

2.8 喹啉類衍生物

Sliman等[29]報道了一系列7-羰基-8-羥基喹啉衍生物（圖6A）對Pim-1具有抑制作用。其中化合物24活性最好（IC50=0.4 μmol/L）。這些活性化合物是以8-羥基喹啉-7-碳酸為核心，分子對接實驗表明雜環部分在Pim-1結合位點被精確放置，芳香環和Phe49苯環的疏水作用可以產生很高的抑制活性，輔助環通過氫鍵作用增強這種作用，而R1、R2、R3、R4四個取代基中最多同時含有一個羥基，另外三個取代基為氫時活性較好，如化合物 25（IC50=0.5 μmol/L）。

A47與咪唑并[1,2-b]噠嗪類化合物的作用方式一致，顯著地損壞鼠科動物依賴Pim-1過表達的VaF3細胞轉變成IL3細胞過程[30]，這表明A47的抗癌活性部分是通過調節Pim-1活性實現。

2.9 苯并呋喃-2-羧酸類

這類化合物（圖6B）的作用模式是：①苯并呋喃5-位取代基與ATP鉸鏈區疏水口袋之間的疏水相互作用是非常重要的結合作用。②2-羧酸基團與Lys67的鹽橋作用和Glu89與Asp186之間的氫鍵作用被認為是另一個非常重要的結合位點。③門看守位置（gate keeper site)附近的多余取代不適合。④在核糖結合區域存在潛在的空間以用于結構擴張。研究發現2-羧酸基團與末端氨基之間的氫鍵作用很重要。其代表者主要有化合物26和27[31]。

圖6 喹啉類衍生物（A）和苯并呋喃-2-羧酸類（B）

3 其他化合物

Anizon等[32]報道一系列的有機金屬復合物（28~30）(圖7)。這類化合物都含一個平面的雜環骨架，一個Ru的雙齒配體，激酶抑制活性低于納摩爾。吡啶咔唑和金屬復合物部分占領與星孢菌素的吲哚咔唑和碳酸酯碎片相同的結合位點。化合物31～33(圖7)是混合型Pim激酶抑制劑，對Pim-1和Pim-2均有抑制作用。

圖7 其他化合物

Tsuganezawa等[33]采用熒光關聯能色譜法從700個化合物中虛擬篩選出的化合物34(圖7)，對Pim-1有抑制作用，體外IC50為150 nmol/L，單晶衍射分析化合物34與Pim-1的復合物結構，發現化合物34主要作用于ATP結合位點，并與殘基Asp128和Glu171直接作用。Sarno等[34]發現ATP位點導向的蛋白激酶CK2抑制劑NBC（Ki=0.22 μmol/L），對Pim激酶也有抑制作用，尤其是對Pim-1和Pim-3，抑制活性與CK2相當。去硝基得到的dNBC對CK2的抑制活性幾乎完全喪失（IC50大于30 μmol/L），而對Pim-1和Pim-3的抑制作用不變。

4 小結

Pim-1蛋白作為新的抗腫瘤靶點，具有較高的選擇性，近年來越來越被關注。與Pim-1相互作用的小分子抑制劑結構類型多樣，暗示Pim-1抑制劑在腫瘤細胞中能鈍化多個靶點。

咪唑并[1,2-b]哌嗪類與Pim-1激酶結合部位相對于ATP類似物抑制劑在利用激酶P-loop時相當特別。很明顯還有很大空間優化這類配體小分子，以提高其Pim-1激酶抑制活性。SGI-1776作為唯一一個進入臨床試驗的小分子抑制劑，對Pim-1，Pim-2，Pim-3都具有較高的抑制作用，對慢性淋巴細胞白血病和前列腺癌細胞具有顯著的細胞毒性效應。5-（3-三氟甲氧基芐烯基）噻唑烷-2，4-二酮可以減少Pim-1在完整細胞中的自動磷酸化，是ATP競爭性抑制劑，對Pim激酶具有選擇性。由于Pim-1激酶在正常細胞中作用不明顯，以及Pim-1激酶的獨特結構，使得結構多樣性的Pim-1小分子抑制劑不會產生很大的副作用，盡管目前還沒有Pim-1激酶抑制劑上市，但是這些研究成果為開發新靶點的抗腫瘤藥物提供了思路。

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