hAFP及hTERT雙啟動子調控的針對人IGF-II基因的siRNA特異性抑制人肝癌細胞生長*

湯紹輝， 吳勝蘭， 王曠靖， 張良鵬， 羅羽宏， 曹明溶， 周鴻科

(暨南大學附屬第一醫院 1消化科， 2普通外科，廣東 廣州 510632)

hAFP及hTERT雙啟動子調控的針對人IGF-II基因的siRNA特異性抑制人肝癌細胞生長*

湯紹輝1， 吳勝蘭1， 王曠靖1， 張良鵬1， 羅羽宏2△， 曹明溶2， 周鴻科1

(暨南大學附屬第一醫院1消化科，2普通外科，廣東 廣州 510632)

目的設計并篩選高效沉默胰島素樣生長因子II(IGF-II)基因的小干擾RNA(siRNA)序列，構建由重組人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)雙啟動子調控的該siRNA表達載體，觀察其對肝癌細胞生長的影響。方法根據siRNA設計原則，參照IGF-II mRNA序列設計3對siRNA序列及1對陰性對照序列，轉染人肝癌Huh7細胞，轉染24 h后采用實時熒光定量PCR檢測IGF-II mRNA表達量變化，篩選干擾效率最高的siRNA序列。采用PCR擴增出hAFP及hTERT啟動子的核心序列，應用基因重組技術構建重組hAFP和hTERT雙啟動子調控的該siRNA表達載體。將上述siRNA表達載體轉染Huh7細胞及L-02人正常肝細胞，觀察IGF-II mRNA表達及細胞生長情況變化。結果實時熒光定量PCR顯示，siRNA3在25 nmol/L濃度時抑制效率最高，約90%。成功擴增hAFP及hTERT啟動子核心序列，將其分別克隆入pGL3-Basic載體，構建成重組pGL3-hAFP-hTERT載體；將siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT載體，構建成重組pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表達載體。Huh7細胞IGF-II mRNA表達量顯著降低，抑制效率達86%，細胞增殖受到明顯抑制，G1期細胞比例顯著增加；L-02細胞上述指標無明顯改變。結論成功構建雙重RNA聚合酶II啟動子(hAFP及hTERT雙啟動子)調控的針對IGF-II基因的siRNA表達載體，即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3；該siRNA表達載體可特異性抑制IGF-II mRNA表達及肝癌細胞生長。

hAFP/hTERT雙啟動子； RNA干擾； 人胰島素樣生長因子II； 癌,肝細胞

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種高效、特異沉默靶基因的新技術。其作用機制是通過雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)經外界導入細胞或細胞內合成后運輸到胞漿中，被Dicer酶識別并加工成21～23 nt長度的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA的反義鏈使同源mRNA降解，從而抑制靶基因表達[1]。目前制備siRNA的方法主要分為兩類：體外合成法與表達載體法。構建siRNA表達載體是通過將siRNA對應的DNA雙鏈克隆到驅動小發夾RNA表達所用的啟動子下游而實現的。驅動這些啟動子轉錄的酶有RNA聚合酶II(RNA polymerase II，Pol II)和RNA聚合酶III(Pol III)，這些啟動子分別被稱為Pol II和Pol III啟動子[2]。Pol III啟動子可在幾乎所有細胞中持續表達，無組織特異性，在腫瘤治療中可能導致人體正常組織損傷；Pol II啟動子，如人甲胎蛋白(human alpha-fetoprotein，hAFP)啟動子和人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動子，則具有組織特異性[2]，可使靶基因在特定的腫瘤組織中沉默[3]。

人胰島素樣生長因子II(insulin-like growth factor II，IGF-II)是一種由67個氨基酸殘基組成的多肽。研究表明，IGF-II的過表達是目前己知的肝細胞癌變過程中發生最早的基因改變事件，對肝癌的發生發展具有重要影響[4-6]。那么，抑制IGF-II的過表達對肝細胞癌是否具有較好的治療作用？目前國內外尚未見深入的研究報道。鑒于此，本研究擬構建雙重RNA聚合酶II啟動子(hAFP及hTERT雙啟動子)調控的針對IGF-II基因的siRNA表達載體，觀察其對肝癌細胞生長的影響，為肝癌基因靶向治療開辟新途徑奠定基礎。

材 料 和 方 法

1材料

pGL3-Basic 載體(圖1)、Lipofectamine? RNAiMAXTM轉染試劑和Wizard?基因組DNA 純化試劑盒均為Promega產品，Trizol試劑為Invitrogen產品，T4 DNA連接酶為TaKaRa產品，DNA凝膠回收試劑盒為廣州東盛生物科技有限公司產品，SYBR Green PCR Master Mix為Toyobo產品，人肝癌細胞株Huh7和人正常肝細胞株L-02購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。

Figure 1. Structure of pGL3-Basic vector.

圖1pGL3-Basic載體結構圖

2方法

2.1針對IGF-II基因的siRNA設計與篩選 根據siRNA設計原則，參照IGF-II mRNA序列(GenBank數據庫：NM_000612)設計并合成3對siRNA序列(siRNA1、siRNA2和siRNA3)及1對無任何靶基因的siRNA(NC siRNA)作為陰性對照。培養Huh7細胞至匯合度為30%～50%，采用Lipofectamine? RNAiMAXTM轉染試劑進行細胞轉染siRNA。實驗分為4個組，即空白對照組(NC siRNA)和3個實驗組(siRNA1、siRNA2和siRNA3)，每組設置25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L siRNA濃度梯度。轉染24 h后，按Trizol試劑盒說明抽提Huh7細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA并進行實時熒光定量PCR擴增。IGF-II mRNA上游引物為5’-CTG GAG ACG TAC TGT GCT A-3’，下游為5’-GAC TGC TTC CAG GTG TCA T-3’，片段長度為128 bp；以18S rRNA為內參照。每個樣本同時擴增3復管，并連續進行2次實驗。采用相對定量法(2-ΔΔCt) 計算目的基因表達量。

2.2重組hAFP和hTERT雙啟動子調控的、針對IGF-II基因的siRNA表達載體構建

2.2.1pGL3-hAFP-hTERT載體構建 根據hAFP基因及hTERT基因啟動子序列設計引物，從L-02細胞基因組中擴增hAFP及hTERT啟動子核心片段(分別為269 bp及456 bp)。hAFP啟動子上游引物為5’-cgg ggt acc TGA GGA GAA TAT TTG TTA TAT-3’(含KpnI位點)，下游引物為5’-cta gct agc TGT TAT TGG CAG TGG TGG AAG-3’(含NheI位點)；hTERT啟動子上游引物為5’-cta gct agc TGG CCC CTC CCT CGG GTT ACC C-3’(含NheI位點)，下游引物為5’-ccg ctc gag CAT CGC GGG GGT GCC GGG G-3’(含XhoI位點)。

取pGL3-Basic載體及hAFP啟動子PCR產物分別行KpnI與NheI雙酶切，將hAFP啟動子插入pGL3-Basic載體多克隆位點KpnI與NheI之間構建成pGL3-hAFP載體。取pGL3-hAFP載體及hTERT啟動子PCR產物分別行NheI與XhoI雙酶切，將hTERT啟動子插入pGL3-hAFP載體hAFP啟動子下游構建成pGL3-hAFP-hTERT載體。上述重組載體送華大基因公司進行測序分析。

2.3重組hAFP和hTERT雙啟動子調控的siRNA對Huh7細胞IGF-II mRNA表達及細胞生長的影響2.3.1細胞轉染及IGF-II mRNA表達分析 采用LipofectamineTM2000轉染試劑將pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表達載體及陰性對照載體pGL3-hAFP-hTERT分別轉染Huh7細胞及L-02細胞。實驗中，每個共轉染實驗同時做3復孔，并連續進行2次實驗。轉染48 h后收集細胞，按Trizol試劑盒說明抽提細胞總RNA，檢測IGF-II mRNA 表達水平，方法同前。

2.3.2MTS法檢測細胞增殖 取上述各組轉染細胞，計數，調整細胞濃度為1×108/L，分到96孔板，每孔100 μL。細胞貼壁后，收集各個時點的細胞(0 h、24 h、48 h和72 h)，加入MTS，比例為1/10。孵育4 h后，酶標儀測定A490值。

2.3.3流式細胞儀檢測細胞周期 轉染48 h后每樣離心收集1×106細胞，用PBS洗細胞2次，加入預冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜。離心收集細胞，用PBS洗細胞1次，加入含50 mg/L溴化丙啶和100 mg/L RNase A的PBS，4 ℃避光孵育30 min，以標準程序用流式細胞儀檢測。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示,組間均數比較采用One-way ANOVA，應用SPSS 13.0統計軟件進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1針對IGF-II基因的siRNA設計與篩選結果

根據IGF-II mRNA序列，設計并合成了3對siRNA，即siRNA1、siRNA2及siRNA3,見表1，分別轉染Huh7細胞。轉染24 h后，采用實時熒光定量PCR檢測Huh7細胞IGF-II mRNA表達量變化。結果顯示，轉染siRNA1、siRNA2和siRNA3的Huh7細胞中IGF-II mRNA表達量均有不同程度的降低，抑制效率約為65%～90%，其中siRNA3在25 nmol/L濃度時抑制效率最高，達90%,見圖2。

表1 siRNA序列

Figure 2. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene on IGF-II mRNA expression in Huh7 cells detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Mean±SD.n=6.

圖2各siRNA轉染Huh7肝癌細胞24h后對IGF-IImRNA表達的影響

2hAFP和hTERT雙啟動子調控的、針對IGF-II基因的siRNA表達載體構建結果

圖3顯示pGL3-hAFP-hTERT重組載體2個陽性克隆的雙酶切產物電泳結果。根據上述篩選出的siRNA3，設計表達siRNA3的序列，制備雙鏈siRNA3，克隆入pGL3-hAFP-hTERT載體雙啟動子下游(XhoI與HindIII位點之間)構建成pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表達載體。測序結果顯示，上述各重組載體插入片段序列正確，無突變。

Figure 3. Electrophoresis analysis of pGL3-hAFP-hTERTvectors (A) and their dual enzyme (KpnI andNheI) digestion products (B). M: DNA marker.Arrows indicate the positive target fragments of about 725 bp (hAFP-hTERTdual promoter fragment).

圖3pGL3-hAFP-hTERT載體及其雙酶(KpnI和NheI)切產物電泳分析

3重組hAFP和hTERT雙啟動子調控的siRNA可特異性抑制Huh7細胞IGF-IImRNA表達及細胞生長

圖4顯示，與轉染陰性對照載體pGL3-hAFP-hTERT(negative control)及空白對照(blank control)相比，轉染pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表達載體(siRNA)的Huh7細胞IGF-II mRNA表達量顯著降低，抑制效率達86%(P<0.05)。如此同時，在L-02細胞中，3組IGF-II mRNA表達量無明顯變化(P>0.05)。

Figure 4. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters on IGF-II mRNA expression in Huh7 cells (A) or L-02 cells (B).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnegative control or blank control.

圖4hAFP和hTERT雙啟動子調控的siRNA對Huh7細胞及L-02細胞IGF-IImRNA表達的影響

圖5與圖6顯示，與轉染negative control及blank control相比，轉染siRNA的Huh7細胞增殖受到明顯抑制，轉染后第2天及第3天差異有統計學意義(P<0.05)；細胞周期檢測顯示G1期細胞比例顯著增加(P<0.05)。而3組L-02細胞增殖及G1期細胞比例無明顯差異(P>0.05)。

討 論

人IGF-II基因是一個復雜的轉錄調控單位，具有9個外顯子和4個啟動子(P1～P4)[7]。在個體不同組織及不同生長發育階段，4個啟動子呈現動態活性，總共編碼5種5′端非翻譯區不同的IGF-II mRNA，但其成熟蛋白產物相同。例如，在胎兒和新生兒肝臟中，IGF-II mRNA高水平表達，其轉錄來源于P2～P4啟動子激活，其中P3 活性最大，P1 失活；在出生2個月后，肝臟IGF-II mRNA表達量則顯著下調，約為新生兒峰值的1/10，一直至成人期都維持于此低水平狀態，其表達主要受控于P1 啟動子，P2～P4啟動子活性弱或呈關閉狀態[8]。

Figure 5. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters on the proliferation of Huh7 cells (A) or L-02 cells (B).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnegative control or blank control.

圖5hAFP和hTERT雙啟動子調控的siRNA對Huh7細胞及L-02細胞增殖的影響

Figure 6. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters on the cell cycle distribution of Huh7 cells or L-02 cells.Mean±SD.n=6. The percentage of Huh7 cells in G1phase increased significantly in siRNA group compared with negative control or blank control group (P<0.05), and there were no differences of the cell cycle distribution of L-02 cells among the above three groups (P>0.05).

圖6hAFP和hTERT雙啟動子調控的siRNA對Huh7細胞及L-02細胞細胞周期分布的影響

我們課題組和其他學者研究發現，由于P3、P4啟動子再激活而導致的IGF-II過表達與肝細胞癌的發生發展密切相關[4-6,9-10]。Dong等[10]報道，肝細胞癌的癌灶、癌旁和遠離癌灶的非癌組織中IGF-II mRNA的表達率分別為100%、53.3%和0%，提示IGF-II特異表達于癌變肝細胞及部分不典型增生的癌前肝細胞，正常肝細胞則無表達。將IGF-II反義RNA導入HepG2肝癌細胞后，細胞增殖率下降，凋亡率增加，AFP分泌水平降低，且惡性表型受到顯著抑制[11-12]。上述結果提示，IGF-II的過表達對肝細胞癌的發生發展具有重要影響，抑制IGF-II的過表達可能成為肝細胞癌治療的新靶點。

RNAi是一種經濟、快捷、高效抑制特異基因表達的新技術[13]，可能成為惡性腫瘤基因治療新的選擇和希望。siRNA是RNAi過程中的關鍵中間產物，目前構建siRNA表達載體采用的啟動子有Pol II和Pol III啟動子，前者包括survivin、hTERT、hAFP啟動子等，后者包括H1、U6、tRNA啟動子等[2]。Pol III啟動子的優點是能夠在精確的位置啟動與終止轉錄，表達的siRNA可以在體內實現高效而穩定的基因沉默，但其不足是無組織特異性，在腫瘤基因治療時可能導致人體正常組織損傷[3]。Pol II啟動子的優點是具有組織特異性，可使靶基因在特定的腫瘤組織中沉默，但其不足是轉錄活性較低[14]。有研究顯示，串聯2個啟動子的核心序列可以增強其轉錄活性[15-16]。

hAFP是目前特異性最強的肝細胞癌腫瘤標記物，肝細胞癌中hAFP 的陽性率為70%～90%。但是，生殖腺胚胎瘤及少數胃癌、肝炎、肝硬化可較低水平表達hAFP。hTERT是維持端粒酶活性所必需的催化亞單位，hTERT 在85%～90%的惡性腫瘤及86%肝細胞癌中高表達，而正常細胞則低表達或幾乎不表達[17]。因此，將hAFP啟動子及hTERT啟動子二者串聯構建成雙啟動子來調控siRNA表達，理論上可能只對表達hAFP和(或)hTERT的肝癌細胞靶基因產生特異性沉默作用，而對正常肝細胞幾乎不產生影響。

在本研究中，我們根據siRNA設計原則，參照IGF-II mRNA序列設計3對siRNA序列及1對陰性對照序列，分別以25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L濃度通過脂質體法轉染肝癌細胞Huh7。結果顯示，轉染siRNA1、siRNA2和siRNA3的Huh7細胞IGF-II mRNA表達量均顯示不同程度的下降，其中siRNA3在25 nmol/L濃度時抑制效率最高，為90%。隨后，我們成功構建成重組pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表達載體,并將其轉染Huh7細胞(表達IGF-II、hAFP 及hTERT)及L-02細胞(表達IGF-II，不表達hAFP 及hTERT)。結果顯示，Huh7細胞IGF-II mRNA表達量顯著下調，細胞生長受到明顯抑制，而L-02細胞IGF-II mRNA表達量及細胞生長無明顯改變，提示hAFP/hTERT雙啟動子調控的siRNA可特異性抑制肝癌細胞IGF-II表達及細胞生長，對正常肝細胞無明顯影響，為肝癌的基因靶向治療提供一種新的選擇奠定了基礎。本結果與Chen等[16]的研究報道相似，他們發現hAFP/hTERT雙啟動子有較高的轉錄活性，并可靶向介導miR-26a在肝癌細胞中表達，特異性抑制其生長。

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HumanIGF-IIsiRNAdrivenbyhAFP/hTERTdualpromotersspecificallysuppressesgrowthofhumanhepatocellularcarcinomacells

TANG Shao-hui1, WU Sheng-lan1, WANG Kuang-jing1, ZHANG Liang-peng1, LUO Yu-hong2, CAO Ming-rong2, ZHOU Hong-ke1

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:yuhongluo123@163.com)

AIM: To design and screen the most effective siRNA targeting human insulin-like growth factor II (IGF-II) gene, to construct an siRNA expression vector driven byhAFP(human alpha-fetoprotein)/hTERT(human telomerase reverse transcriptase) dual promoters, and to observe the effect of the siRNA on the growth of human hepatocellular carcinoma cells.METHODSThree siRNAs targetingIGF-IIgene and one negative control siRNA were designed and synthesized. They were transfected into human hepatocellular carcinoma Huh7 cells. The expression IGF-II mRNA in Huh7 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR 24 h after transfection to screen the most effective siRNA. The core sequences ofhAFPandhTERTpromoters and the most effective siRNA were cloned into pGL3-basic vector to construct the siRNA expression vector driven byhAFPandhTERTpromoters. The siRNA expression vector was transfected into Huh7 cells and human normal liver L-02 cells, and then the IGF-II mRNA expression in these cells and the cell growth were evaluated.RESULTSThe inhibitory effect of siRNA3 on IGF-II mRNA expression was the strongest at the concentration of 25 nmol/L, with an inhibitory rate of approximately 90%. The core sequence fragments ofhAFPandhTERTpromoters and siRNA3 were successfully cloned into pGL3-basic vector. The expression of IGF-II mRNA in the transfected Huh7 cells was reduced by approximately 86%, and proliferation inhibition and G1-phase arrest of the cells were also observed. However, there were no differences of the above parameters in L-02 cells before and after transfection.CONCLUSIONThe siRNA expression vector targeting humanIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters was successfully constructed. The siRNA3 expression vector may specifically suppress the expression of IGF-II mRNA and the growth of hepatocellular carcinoma cells.

hTERT/hAFPdual promoters; RNA interference; Insulin-like growth factor II; Carcinoma,hepatocellular

R735

A

1000- 4718(2013)08- 1422- 06

2013- 03- 18

2013- 07- 02

廣東省科技計劃(No.2012B031800399)；廣州市科技計劃(No.2011J4100077)；暨南大學第一臨床醫學院科研培育專項基金資助項目(No.2013107)

△通訊作者Tel: 020-38688039; E-mail: yuhongluo123@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.08.014