梨采后病害拮抗菌的分離與篩選

張曉宇，張則君，韓巨才

（1.山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，山西太原030031；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

梨采后貯藏期和貨架期易被病害侵染，果肉易軟化腐爛，對貯藏保鮮造成很大困難，給果農造成極大的經濟損失。隨著社會的發展，人們對果蔬質量的要求不斷提高，環保意識不斷加強，迫切需要新的安全有效的方法來控制果蔬的采后病害。由于生物抑菌劑防病效果明顯、無毒，且成本低，成為果蔬保鮮的重要發展方向，也是減少化學藥劑使用量的有效途徑[1]。

對梨采后病害的拮抗菌研究始于20世紀80年代，Chand 等[2]和 Sugar等[3]分別發現了 Cryptococcus albidus和Cryptococcus infirmominiatus，用于抑制青霉菌（Penicillium expansum）；Janisiewicz等[4]和 Lima等[5]分別發現了Pseudomonas syringae和Rhodotorula glutinis，用于抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）；謝莉[6]和齊冬梅等[7]分別發現了Streptomyces aureus和Bacillus subtilis，用于抑制鏈格孢菌（Alternaria alternata）。用于生物防治的拮抗菌涵蓋了細菌、酵母菌和放線菌，充分說明生防菌具有巨大的發展潛力。

本試驗從各種水果和葉片表面進行拮抗菌的分離，篩選出對梨采后致病菌有拮抗作用的細菌，旨在為探索新的梨采后病害防治途徑提供一定理論指導。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 梨、杏、西梅、黑李、冬棗、葡萄、山楂、桃無病蟲害及機械損傷的果實和葉片 梨采自山西省清徐縣高花鄉高花村，杏采自山西省大同市陽高縣，西梅、黑李、桃均采自山西省太原市金灘村，山楂分別采自山西省太原市金灘村和山西省太谷縣，冬棗采自山東省沾化縣，葡萄采自山西省清徐縣。試材于2011年8—9月采回，當天運回實驗室，裝袋后存放于冰箱。

1.1.2 供試病原菌 梨鏈格孢菌（Alternaria alternata）、梨鐮刀菌（Fusarlum poae）、梨毛霉菌（Mucoraceae racemosus）均由山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所采后病理研究室分離保存。將病原菌在PDA培養基上28℃培養7～14 d，用無菌水制成孢子懸浮液，血球計數板計配濃度為1×104個孢子/mL。

1.1.3 培養基 牛肉膏蛋白胨（NA）培養基：牛肉膏為 5 g，蛋白胨為10 g，NaCl為 5 g，瓊脂粉為10 g，水1 000 mL，pH值7.2；酵母膏蛋白胨（LA）培養基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉 10 g，水1 000 mL，pH 值 7.4；馬鈴薯（PDA）培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 10 g，水 1 000 mL，pH值為6.5～7.0。

1.2 拮抗菌的分離

分別取梨、梨葉、杏、杏葉、西梅、黑李、冬棗、葡萄、葡萄葉、山楂、山楂葉、桃、桃葉放入燒杯中，使用0.05 mL/L的磷酸緩沖液（pH值為6.5）沖洗2次，第1次在搖床100 r/min旋轉振蕩器中洗滌10 min，保留洗液；第2次用超聲沖洗10 min，保留洗液。

取無病無傷、大小和成熟度相似的梨果，用2%的次氯酸鈉溶液表面消毒后，自然晾干。在梨果上用接種針挖3 mm×3 mm的孔，每個孔注入2次的洗液各20 μL，待晾干后再注入病原菌孢子懸浮液20 μL（1×104個孢子 /mL）。晾干后將梨果裝入塑料筐內，套保鮮袋，扎口，保持濕度在95%左右，室溫下7 d后檢查。選取未發病，且傷口處長有拮抗菌菌落形態的梨果，用無菌接種針刮取菌落表層，在研缽中研碎。用0.05 mL/L的磷酸緩沖液（pH值為6.5）定容4 mL，分別稀釋10倍和100倍。分別取此稀釋后的懸浮液各100 mL，用涂布器分別涂在NA，LA培養基上。培養48 h后，把具有不同形態特征的單一菌落分別在NA，LA培養基平皿上劃線，挑取純化后的單菌落，用小試管斜面保存備用。

1.3 拮抗菌的篩選

采用平板對峙培養法[8]，處理用直徑1 cm的打孔器取病原菌菌塊放于PDA平板中央，在距其2.5 cm的地方用無菌接種針各沾一環單菌落劃一條線，同時以不劃線直接病原菌菌塊為對照，每個處理重復3次。培養4～6 d后，觀察不同菌株是否對病原菌有抑制生長的作用及測量抑菌圈的大小。按照抑菌半徑的大小，將拮抗菌的拮抗作用分為強、中、弱3類。

2 結果與分析

結果表明，從梨果表面共獲得細菌分離物89株，再經過篩選試驗得到以下結果。

2.1 拮抗細菌對植物病原真菌的抑制作用

以梨鏈格孢菌（Alternaria alternata）、梨鐮刀菌（Fusarlum poae）、梨毛霉菌（Mucoraceae racemosus）為靶標菌，用平板對峙培養法測試了89株菌對病原真菌的拮抗作用，結果表明，有5株細菌菌株對3種病原真菌均具有較強的拮抗作用，占篩選到菌株總數的5.6%。

從表1可以看出，拮抗細菌菌株可以分為3類：HM3和XM2除菌落大小不同外，具有相似的菌落形態特征；XY1區別于其他菌株的最大特點是其呈黃綠色透明狀；HJL6和L4具有相似的菌落形態特征。

表1 拮抗細菌菌落的形態特征

2.2 細菌對梨鏈格孢菌的抑制作用

通過對89株細菌菌株進行生長對峙試驗，結果發現，有10株菌對梨鏈格孢菌的生長有抑制作用，占到菌株總數的11.2%；對梨鏈格孢菌有較強抑菌作用的菌株是 HM3，HM2，XM2，XY1，TYSZ6，PT4；對梨鏈格孢菌抑菌作用較弱的菌株是HJL6，HJL4，L4，DZ2；其余菌株對梨鏈格孢菌無拮抗作用。其中，HM3和HM2的抑菌效果最為明顯，其抑菌率達到95%以上（表2）。

表2 細菌對梨鏈格孢菌的抑制效果

2.3 細菌對梨鐮刀菌的抑制作用

通過對89株細菌菌株進行生長對峙試驗，結果發現，有15個菌對梨鐮刀菌的生長有抑制作用，占菌株總數的16.9%，其中，有較強抑菌作用的菌株 是 HJL6，L4，HM3，HM2，XY1，DZ2，TYSZ6，PT4，SL2，抑菌作用較弱的菌株是 XM2，HJL4，HJL5，XM1，HM4，DZ1，其余菌株無拮抗作用。其中，HJL6，HM2和XY1的抑菌效果最為明顯，其抑菌率達到95%以上（表3）。

表3 細菌對梨鐮刀菌的抑制效果

2.4 細菌對梨毛霉菌的抑制作用

通過對89株細菌菌株進行生長對峙試驗，結果發現，有11個菌株對梨毛霉菌的生長有抑制作用，占菌株總數的12.4%，有較強抑菌作用的菌株是 HJL4，XM2，HM3，L4，XY1，TYSZ6，抑菌作用較弱的菌株是 XM1，SZY3，TYSZ7，TGSZ2，TY3，其余菌株無拮抗作用。其中，HJL4和XM2的抑菌效果最為明顯，其抑菌率達到95%以上（表4）。

表4 細菌對梨毛霉菌的抑制效果

3 結論與討論

根據本試驗篩選的有拮抗作用的細菌形態特征初步推知，拮抗細菌的菌落形態各異，拮抗能力與菌落形態并不存在必然聯系。另外，大量的研究表明[9-13]，離體（in vitro）條件下和活體（in vivo）條件下的拮抗能力不一定一致，不存在相關性，不能根據一個方面的抗病能力就淘汰或肯定一株細菌。

本試驗得到的HM3和XY1這2株細菌對梨鏈格孢菌（Alternaria alternata）、梨鐮刀菌（Fusarlum poae）、梨毛霉菌（Mucoraceae racemosus）3 種致病菌均有顯著抑菌效果，還有待于對其進行生理生化和分子生物學鑒定，并對其進行抑菌譜的測定，以便為梨采后病害生物防治提供理論依據。

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