EMS 誘發菊花突變類型及重要性狀的分子鑒定

蔡海燕，溫立柱，鄭成淑*，李瑩瑩，2，孫 霞，孫憲芝

(1.山東農業大學園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018;2.菏澤學院園林工程學系，山東 菏澤 274015)

菊花(Chrysanthemum morifolium)是我國傳統名花，也是世界四大切花之一，其產量和銷量均位于世界花卉前列［1］。然而，由于菊花基因背景復雜，染色體倍數變化較大(2～8 倍)，而栽培品種的染色體倍數大多在4 倍以上，傳統的雜交育種和轉基因育種均受到一定的限制［2，3］。

EMS 是一種有效的化學誘變劑，使用其誘變可以產生豐富的突變體，無需遺傳轉化，即可快速獲得一些不同性狀的新的優良種質資源，而且其作用是誘發點突變，不易對染色體造成畸變，穩定性好，因而被廣泛的用于構建突變類型。目前利用EMS 誘變劑已在小麥［4］、油菜［5］、擬南芥［6］、水稻［7］等多種植物中成功構建了各種突變類型，并已用于新品種培育和功能基因組學的研究中。

菊花屬異花授粉植物，雜交后代結實率和出芽率均較低，很難出現較理想的雜交變異或自然變異。利用EMS 誘變菊花可短期內產生大量的變異類型，但相關研究迄今鮮見報道。因此，本試驗利用EMS 誘變劑處理菊花莖尖，以其M1代無性系的突變體株系為材料，對其突變類型進行鑒定分析，結果將對培育優良觀賞性狀的菊花新品種和菊花功能基因組學研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為長勢均勻一致、健壯、高約15 cm 的菊品種‘神馬’。

1.2 試驗方法

試驗于2011年開始進行。用0%(對照)、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.6%甲基磺酸乙酯(EMS)處理菊花莖尖。EMS 滴于植株莖尖的棉團上。待棉團將干時重復操作。6 h 后，移去棉團，用10% NaS2O3溶液涂抹莖尖終止誘變反應，再用流水沖洗。在莖尖內側用紅色油性筆留下標記。待植株從標記的部位向上長約8 cm 時，取插穗(約8 cm)，進行扦插，生根后移栽。對照單獨定植于一個畦上。對照與處理統一澆水、施肥、打藥。從EMS 處理后每天觀察植株各部位的變化，隨時記錄和拍照各種變異類型。

1.3 DNA 提取及ISSR 分析

取早花的花蕾及黃綠色的花蕾作為提取DNA 的材料。采用試劑盒(天根生物科技有限公司生產)法提取DNA。

引物選用前人文獻中篩選出的;PCR 擴增的反應體系為20μL，擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性45 s，55℃復性40 s，72℃延伸70 s，45個循環;72℃延伸7 min，4℃保存。擴增反應結束后，取5μL擴增產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，照相。

1.4 測量與計算方法

株高測量:待植株營養生長停止后進行株高測量。

花期測定:花蕾期(花蕾直徑約0.2 cm)、初開期(花朵開始露白)和盛開期(花朵半開)。

突變率計算:表型突變率=(總變異株數/EMS 處理后成活的總株數)×100%;葉片突變率=(總葉片變異株數/EMS 處理后成活的總株數)×100%;花瓣突變率=(總花瓣變異株數/EMS 處理后成活的總株數)×100%;以此類推。

2 結果與分析

2.1 株高變化

對照的菊花株高為108.21 cm(圖1－CK)。EMS 誘變的菊花株高突變體中平均株高為18.81 cm，其中，株高最高的達58.3 cm，最低為8.0 cm(圖1－1－3)。株高低于10 cm 的有92株，高于20 cm 的有160株。大多數突變體株高在12～16 cm 之間。

2.2 葉片變化

在葉片突變體中共觀察到64株發生了變異，葉片突變頻率為1.45%，包括葉片形態突變體和葉片顏色突變體，其中變化最大的葉片由原來的單葉變為復葉(圖2－4)。未見全株葉片都發生突變的植株。

2.2.1 葉片形態變化 (1)葉的整體形態變化:對照葉形為近卵形(圖2－CK)，而突變體中發現了披針形葉(圖2－4、6)，近圓形葉(圖2－7、8、12)，非對稱葉片，葉片一側部分缺失(圖2－9);(2)葉緣變化:對照的葉緣多鋸齒(圖2－CK)，突變體中發現了全緣形(圖2－5、7、8、10、12)，牙齒狀(圖2－1)，波浪狀(圖2－2、4)的葉緣;(3)葉裂變化:對照的葉裂形態屬深裂形，有兩對對稱的深裂溝。突變體中出現了葉片只有一對深裂溝(圖2－3、11)，葉片呈淺裂形(圖2－9)，葉片無明顯的裂溝或者全無裂溝(圖2－1、2、7、10);(4)葉尖變化:對照葉片的葉尖為漸尖形。在突變體中發現了銳尖(圖2－1、2、3、12)，鈍尖(圖2－5、8)，截形或呈一直線(圖2－7)，凹形(圖2－10)的葉尖;(5)葉基變化:對照葉片的葉基為心形，而突變體中的葉基則呈耳垂形(圖2－3)、楔形(圖2－7、8)、偏斜(圖2－5)和圓形等(圖2－10)。葉基的形狀主要有8 種，而突變體中新出現的葉基有4 種;(6)葉脈變化:對照葉片的葉脈清晰明顯，主脈大致成一直線位于整個葉片的中間。突變體中發現了主脈偏于葉片的一側，其中一種葉脈不明顯(圖2－8)，另一種葉脈的主脈呈弧形(圖2－6)。

2.2.2 葉片顏色變化 發現葉片顏色突變體共12株，突變頻率為0.27%。表現為葉片基部發黃，并沿主脈向葉片邊緣黃色逐漸變淡，最后消失(圖2－10);葉片邊緣泛黃，向內黃色逐漸變淡，主脈及各側脈顏色發綠(圖2－11);黃斑不均勻的散布于整個葉片表面(圖2－12)。

圖1 菊花‘神馬’株高的突變體形狀Fig.1 Phenotype of plant height mutants

圖2 菊花‘神馬’葉片突變體形狀Fig.2 Phenotype of the leaf mutants of chrysanthemum‘Jinba’of chrysanthemum‘Jinba’

2.3 花期變化

‘神馬’屬典型的短日照植物，在每天連續黑暗大于13 h 的條件下才能形成花蕾進而開花。山東地區‘神馬’的花期一般在10月下旬。本試驗中出現了159株花期提早的突變體，突變頻率為3.59%。1株突變體在6月5日，即定植后的第34 d 就形成小花蕾(表1)。7月6日，有1株突變體花蕾已露白，進入初開期。最早進入盛開期的1株突變體的日期為7月18日，但從7月18日至8月1日期間只有23株花朵完全正常開放。此結果說明EMS 誘變的菊花突變體不必經過短日照，在長日照下也可進行花芽分化，并正常開花。

其余未正常開放的原因是:有些花蕾發育過程中凋萎;有些花朵初開期中外輪花瓣就開始枯萎，以致花不能正常開放。這可能是由于EMS 引起了菊花細胞染色體畸變，對植株造成一定的生理損傷，以致不能正常開花。

表1 EMS 誘變菊花‘神馬’花提早發育情況Table 1 Early flower development of chrysanthemum ‘Jinba’induced with EMS

2.4 花器官變化

菊花的花屬于頭狀花序，包括花苞、舌狀花、筒狀花、雄蕊和雌蕊等部分。該突變體中共發現233株花器官突變體，突變頻率為5.27%。

2.4.1 花蕾變化 花蕾突變體包括花蕾形狀突變、花蕾顏色突變和花蕾敗育。

(1)花蕾形狀變化 共發現12株，突變頻率為0.27%。與對照花蕾形狀(圖3－A－CK)相比，突變中出現了:花蕾分為上、下2 層，整體呈扁圓形(圖3－A－1)和圓柱形(圖3－A－2);花蕾倒圓錐形(圖3－A－3);花蕾呈圓球形(圖3－A－4)。

(2)花蕾顏色變化 共發現8株花蕾顏色變化，突變頻率為0.18%。一種變異類型為花蕾呈紫色(圖3－A－5)，另一種變異類型為花蕾呈黃綠色(圖3－A－6)。

(3)花蕾敗育 共發現16株花蕾敗育，突變頻率為0.36%。花蕾形成不久枯萎，內部舌狀花和管狀花褐化，雌蕊和雄蕊消失(圖3－A－7－8)。

2.4.2 頭狀花序變化 包括以下幾種。

(1)花苞變化 共發現16個植株的花苞發生了突變，突變頻率為0.36%。與對照相比(圖4－B－CK)，花苞突變分別表現為:外輪花苞片葉片化(圖4－B－1);兩輪相鄰的花苞片之間彼此分離，形成較大的空腔(圖4－B－2);外輪花苞片上密被白色絲狀物(圖4－B－3);花苞上覆有白色透明黏液物(圖4－B－4)。

(2)花序變化 共發現185株花序突變，突變頻率約為4.18%。與對照相比(圖4－C－CK)，花序突變有以下不同表現:花序盤中出現花苞片，且其著生位置不確定，數量多少不等(圖4－C－1－5);花序盤中花苞片發育不良或缺失，花序呈部分外露(圖4－C－6－8)或全露(圖4－C－9);花序部分缺失(圖4－C－10);舌狀花與管狀花缺失(圖4－C－11－12)。

圖3 EMS 誘變菊花‘神馬’花蕾突變體Fig.3 The flower bud mutants of chrysanthemum＇Jinba＇induced by EMS

圖4 EMS 誘發菊花花苞及花序突變體類型Fig.4 Phenotype of the involucres and inflorescences mutants of chrysanthemum ＇Jinba＇induced by EMS

(3)舌狀花變化 共發現舌狀花突變體92個(57株)，突變頻率為2.08%。與對照(圖5－CK)相比，出現了以下3 種變化類型:①舌狀花形狀變化 包括以下幾種類型:舌狀花體積變小(圖5－a－1);舌狀花變寬，有的有花柄(圖5－a－2～5);舌狀花的基部有較小的花瓣(圖5－b－2～4)。另外，有的舌狀花基部出現萼片(圖5－b－1)。②舌狀花筒狀 一種是整個舌狀花都合生成筒狀(圖5－c－1)，另一種是舌狀花的中下部合生成筒狀，上部開裂(圖5－c－2～5)。③舌狀花中的雌蕊敗育 舌狀花內雌蕊敗育，但出現一個葉芽(圖5－d－1)或完整的花盤(圖5－d－2)或正常形態花蕾(圖5－d－3)，并且葉芽能繼續發育長出多個小葉(圖5－d－4)。

2.5 分子鑒定

引物引物(CAC)3GC 對早花突變體的ISSR－PCR 擴增結果顯示，處理植株的DNA 擴增條帶與對照相比存在差異性條帶(圖6)。與對照不同，突變體無500 bp和2000 bp 位點的條帶。初步推斷這些突變體植株的早花特性可能是由菊花基因組中開花相關基因發生了突變引起。這說明早花特性不是環境因素造成，而是由于基因突變所致。

引物(CA)6GT 對黃綠色部位提取的DNA 擴增結果顯示，突變體比對照多了一條約300 bp 大小的條帶(圖7)。表明突變體與對照的基因存在差別，此突變也是基因型突變。

圖5 菊花‘神馬’舌狀花突變體Fig.5 The lingulate flower mutants of chrysanthemum ＇Jinba＇

圖6 對早花突變體的擴增結果Fig.6 Amplification rusults of early flowering mutant

圖7 黃綠色花蕾突變體的擴增結果Fig.7 Amplification rusults of chartreuse bud mutant

3 討論

本試驗用EMS 處理‘神馬’，共成活4423株。對成活的M1株系進行株高、葉片、花期、花苞、花蕾、花瓣等重要觀賞性狀進行調查和統計發現，共有279株發生了不同程度的變化，其表型變化頻率達到6.31%。這說明在同一遺傳背景下EMS 誘導菊花變異類型豐富多樣。且成功獲得了花期提早突變體植株，分子鑒定結果也表明其基因發生了變異。這為將來菊花開花基因調控機制研究和相關功能基因的克隆和分析提供了良好的基礎材料。

EMS 誘發基因點突變。可對某一特定性狀改良，例如，提高煙草葉片的產量［8］，提高草菇的耐寒性［9］。雖然EMS 誘變產生的不良突變較多，但從本試驗所獲得的突變體中也獲得了一些優良的菊花突變體性狀，如上述的黃綠色花蕾、提前開花等性狀的突變體，并且控制這些優良性狀的基因源于人工誘變，與來自自然變異的基因或等位基因不同，是一種新的優異基因，在其后代若通過特異性、一致性和穩定性鑒定，有可能作為新的品種進行商品化生產。隨著研究的深入，控制這些優良性狀的基因將會不斷被發現，并為菊花分子育種提供理想的材料。

［1］王文利，王秀峰，鄭成淑，等.A23187和EGTA 對光周期誘導菊花成花及其過程中葉片Ca2+分布和碳水化合物的影響［J］.應用生態學報，2010，21(3):675－682

［2］Dowrick GJ.The chromosomes of chrysanthemum.I:the species［J］.Heredity，1952，6，365－375

［3］李 暢，陳發棣，趙宏波，等.切花菊14個品種的核形態學研究［J］.園藝學報，2007，34(5):1235－1242

［4］趙天祥，孔秀英，周榮華，等.EMS 誘變六倍體小麥偃展4110 的形態突變體鑒定與分析［J］.中國農業科學，2009，42(3):755－764

［5］孫加焱，涂進東，范叔味，等.甘藍型油菜理化誘變和突變體庫的構建［J］.遺傳，2007，29(4):475－482

［6］McCallum CM，Comai L，Greene EA，et al.Targeted screening for induced mutations［J］.Nature Biotechnology，2000，18(4):455－457

［7］Hu LF，Tan HX，Liang WQ，et al.The Post－meiotic Deficicent Anther1 (PDA1)gene is required for post－meiotic anther development in rice［J］.Journal of Genet Genomics，2010，37:37－46

［8］Reddy TV，Dwivedi S，Sharma NK.Development of TILLING by sequencing platform towards enhanced leaf yield in tobacco［J］.Industrial -Crops Products，2012，40:324－335

［9］Liu Z，Zhang K，Lin JF，et al.Breeding cold tolerance strain by chemical mutagenesis in Volvariella volvacea［J］.Scientia Horticulturae，2011，130(1):18－24