電化學發光免疫傳感器檢測相思子毒素研究*

劉 冰，童朝陽，郝蘭群，穆晞惠，劉 威，黃啟斌

（防化研究院國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205）

0 引言

電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）是一種電化學反應引起化學發光的現象，具有操作簡便、靈敏度高、背景信號低、易于控制等特點。免疫磁性微球分離技術通過免疫反應與磁性微球的分離作用能從復雜的生物樣品中特異性捕獲并分離被檢抗原或抗體。近年來，磁免疫分離和電化學發光分析方法不斷發展，二者結合的磁免疫電化學發光分析方法已被用于檢測一些抗原、抗體和半抗原［1～4］，尤其是臨床醫學檢驗上。

相思子毒素（abrin）來源于豆科植物相思子種子，是一種Ⅱ型核糖體失活蛋白，其結構、作用機理與蓖麻毒素（ricin）類似，毒性超過ricin，屬劇毒生物毒素，可以作為潛在的生物戰劑被恐怖分子使用，近幾年已引起廣泛關注，建立快速、靈敏的檢測方法極為必要。已經建立的酶聯免疫吸附測定（ELISA）［5～8］、平板上的 ECL［7］、分子生物學（定量PCR、免疫PCR）［9］等方法靈敏度高，但耗時較長;膠體金免疫層析［10～12］、壓電免疫傳感器［13］等速度較快 但靈敏度稍低。

本研究將磁免疫分離技術、生物素—親和素系統（BAS）的放大作用、多抗的強富集能力以及三聯吡啶釕［Ru（bpy］標記單抗的高度特異性結合起來，建立了一種操作簡便、響應快速、靈敏度高的磁免疫電化學發光傳感檢測方法，為臨床診斷、環境監測、食品衛生檢驗及生物反恐等應用領域提供技術基礎和參考依據。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

磁免疫電化學發光傳感檢測平臺（本實驗室與西安瑞邁分析儀器有限責任公司聯合研制）;MPI—E型電化學發光檢測儀（西安瑞邁分析儀器有限責任公司）;BIOMATE 3S紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技）;HS—3垂直混合器（寧波新芝生物科技股份有限責任公司）;磁分離架（Promega公司）。

1．2 實驗方法

1．2．1 發光探針制備

按照文獻［14，15］方法稍有改動，將1 mg abrin單抗溶于 582 μL 碳酸鹽緩沖液（0．05 mol/L，pH=9．6），加入380 μL Ru（bpy-ester（8．76 × 10－4mol/L），再加入 38 μL二甲基亞砜（DMSO），37℃避光振蕩孵育12 h。超濾除去未結合的 Ru（bpy-ester，用磷酸鹽緩沖液（PBS，0．01 mol/L，pH=7．4）重懸至 1 mL，備用。

1．2．2 捕獲探針制備

1）abrin多抗生物素化

用1 mL DMSO溶解活化生物素1 mg，向1 mL abrin多抗溶液（1 g/L）中加入120 μL活化生物素溶液（即含活化生物素120 μg）;在室溫下持續攪拌，保溫 2～4 h;加入9．6 μL 1 mol/L NH4Cl（每 25 μg 活化生物素加 1 μL），在室溫下攪拌10 min;4℃充分透析，以除去游離的生物素，以PBS重懸至1 mL。

2）磁微球捕獲探針構建

將生物素化的abrin多抗20 μL加入1 mL（1 g/L）親和素包被的磁微球中，室溫振蕩孵育1 h，置于磁分離架上用PBST（含1．5%Tween—20的 PBS）清洗2次，PBS清洗 2次除去未結合的abrin多抗，余下結合了abrin多抗的磁微球，加PBS重懸至1 mL，4℃保存備用。

1．2．3 ECL 檢測

將abrin多抗包被的磁微球50μL和50μL樣品混合后室溫振蕩孵育15 min，用 PBS磁分離清洗2次，再加入Ru（bpy-ester標記的abrin單抗50 μL（20 mg/L）共同振蕩孵育15min，PBS磁分離清洗以除去未結合的標記探針，用發光檢測液重懸后加入檢測池，磁微球在磁鐵作用下沉積在工作電極表面，在1．4 V恒電位下，標記在abrin單抗上的Ru（bpy就和發光檢測液中的三丙胺（TPA）反應，產生光子，光信號由光電倍增管檢測。實驗原理如圖1所示。

圖1 相思子毒素電化學發光檢測原理Fig 1 Principle of ECL detection on abrin

1．2．4 傳感器電極表面再生

ECL檢測反應完成后，將磁鐵位置移至電極遠端，先用去離子水沖洗檢測池，流動注入CleanCell清洗液，反復運行電化學階躍脈沖，再用去離子水反復沖洗，直至注入Pro-Cell發光檢測液后，ECL響應值恢復至基線水平。

2 結果與討論

2．1 發光探針性質

2．1．1 發光探針紫外—可見光譜

如圖2所示，abrin單抗標記后紫外—可見光譜發生改變，a為abrin單抗光譜圖，在280 nm處有一個特征吸收峰，是蛋白特征峰;b為標記物Ru（bpy）-NHS ester的圖譜，聯吡啶釕在220～600 nm之間有3個特征吸收峰，其中，可見光457 nm處的吸收對應于金屬Ru（II）到bpy配體dπ→π*電荷躍遷，紫外區287 nm處的吸收是以配體為中心的π→π*躍遷，紫外區的另一個吸收峰在245 nm處，也是金屬Ru（II）到 bpy配體的 dπ→π* 電荷躍遷［10］;c標記abrin單抗的光譜圖，位于286 nm和457 nm處均為聯吡啶釕的特征吸收，這表明Ru（bpy）-NHS ester已經標記到abrin單抗上。

圖2 標記探針的紫外—可見（UV-Vis）光譜Fig 2 UV-Vis spectrum of labeled probe

2．1．2 發光探針電化學發光性質

在發光檢測液中，利用循環伏安法對標記探針進行掃描，結果如圖3所示。可見Ru（bpy）標記到abrin單抗上后，仍然有較強的電化學發光信號，峰電位保持不變，仍在1．4 V附近，保持了Ru（bpy的電化學發光特性，標記abrin單抗可以用作電化學發光探針。

2．2 傳感器的響應特性

2．2．1 線性與檢出限

圖3 標記探針的電化學發光性質Fig 3 ECL characteristics of labeled probe

圖4為ECL強度（3次重復平均值，扣除基線值）隨abrin濃度變化的關系曲線，可見隨著abrin濃度升高，ECL值逐漸上升;在abrin濃度達1 000 μg/L時不再上升，基本達到飽和。在0．1～1000 μg/L范圍內電化學發光強度（Y）的對數與abrin濃度（X）的對數呈線性關系，擬合方程為lgY=0．763 lgX+0．562（R=0．9903，N=7，P＜0．0001）。因此，傳感器對抗原檢測的線性范圍是0．1～1000 μg/L，當abrin濃度低于0．1 μg/L時，電化學發光強度基本處于基線水平（6～7），因此，檢測下限為0．1 μg/L。這較之前建立的壓電免疫傳感器法檢測abrin［13］在靈敏度上提高500倍，與Garber E A等人［7］建立的固相平板上的ECL水平（不同樣本中0．1～0．5μg/L不等）相當。由于本方法采用的磁性微球懸浮反應體系，使異相反應成類似均相反應，大大加快了反應速度，加上磁性微球的分離富集作用以及便于清洗，與平板上ECL相比，明顯縮短了檢測時間。

圖4 ECL強度與abrin濃度的關系Fig 4 Relationship between ECL intensity and concentration of abrin

2．2．2 特異性

傳感器對空白樣品緩沖液（PBS），100 μg/L的牛血清白蛋白（BSA）、100 μg/L的葡萄球菌腸毒素 B（SEB）與100 μg/L的蓖麻毒素（ricin）的ECL響應值都在基線水平（6～7），對非目標蛋白均不響應，說明該傳感器對abrin檢測有很強的特異性。磁微球固定化多抗作為捕獲探針與標記單抗作為發光探針對abrin的夾心式雙重特異性識別，以及磁微球的分離富集作用，保證了傳感檢測的高度特異性。

2．2．3 檢測重現性

在線性范圍內，對濃度為100 μg/L的abrin重復5次平行測定，ECL值為89±8，相對偏差為9%，傳感器不僅靈敏度高而且重現性較好。

3 結論

本文以磁性微球固定相思子毒素多抗制備捕獲探針，以三聯吡啶釕標記相思子毒素單抗作為發光探針，建立了相思子毒素的磁免疫電化學發光傳感檢測方法。實驗結果表明:利用此方法檢測相思子毒素，響應快速、特異性強、靈敏度高（檢出限為 0．1 μg/L）、線性范圍寬（0．1～ 1 000 μg/L）。可以此為基礎，發展生物毒素和其它蛋白的現場檢測方法，用于臨床診斷、環境監測、食品衛生檢驗及生物防護等應用領域。

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