蘆丁合鐵（Ⅲ）的合成、表征及其與DNA相互作用研究

李艾華，郭艷華，張玉敏

（江漢大學 化學與環境工程學院，湖北 武漢 430056）

蘆丁是存在于植物中的一種黃酮類化合物，廣泛用于醫藥、保健食品中［1-3］。蘆丁具有降低毛細血管通透性、抗炎、抗病毒、鎮痛、抗氧化及抑制醛糖還原酶等藥理活性。近年來，國內外文獻報道蘆丁具有抗癌作用［4］，蘆丁具有3'，4'位二羥基和4-羰基-5-羥基，與金屬離子可螯合成穩定的五元環或六元環［5］。研究表明，許多有機分子配體與金屬配合形成配合物后，其藥效明顯增強。研究發現蘆丁合鐵配合物可以增強蘆丁保護細胞抗損傷的能力及對抗炎癥作用。蘆丁合鐵（Ⅲ）配合物的體外清除氧自由基的能力為單純蘆丁的2～30倍，蘆丁合鐵（Ⅲ）配合物能夠有效對抗博萊霉素誘導的肺水腫［6］。

眾所周知，DNA是生物體的重要組成物質，是遺傳信息的攜帶者和基因表達的物質基礎，它在生物的生長、發育和繁殖等活動中具有十分重要的作用。DNA的結構直接影響其功能，并與致癌、抗癌有關。研究小分子金屬配合物和DNA的相互作用，從而探索DNA的結構與功能的關系，將有助于人們從分子水平上了解生命現象的本質，并從基因水平上理解遺傳病、癌癥、艾滋病等疾病的發病機理，使通過分子設計尋找有效的治療藥物成為可能。鈷、銅、鋅、銪等元素的蘆丁配合物與DNA相互作用的研究已有報道［7-9］，而鐵與DNA相互作用的研究鮮見報道。本實驗合成了蘆丁合鐵配合物，利用紅外、紫外、差熱-熱重分析等方法對合成的蘆丁合鐵進行了檢測，并對蘆丁合鐵與DNA的作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蘆?。˙R）、DNA（BR 批號 F20091118）、無水乙醇（AR）均購于國藥集團化學試劑有限公司；硫酸鐵（AR）購于天津市福晨市化學試劑廠；Ethidium Brmide（BR純度≥98%）購于上海索萊寶生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津；FTIR-8000型紅外光譜儀，日本島津；LS-55熒光分光光度計，美國Perkin Elmer公司；CRY-2P型差熱分析儀，北京光學儀器廠；JJ-1型定時電動攪拌器，江蘇金壇中大儀器廠；DF110型電子分析天平，中國輕工業機械總公司常熟衡器工業公司；數顯恒溫水浴鍋，HH-2國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁合鐵配合物的合成 根據蘆丁合鐵配合物的合成條件，按下列較優方法合成：將1.4 g（約2 mmo1）蘆丁與40 mL無水乙醇投入到250 mL三口燒瓶中，微熱使其完全溶解，再加入0.4 g無水碳酸鈉攪拌1 h，即有黃色的蘆丁鈉鹽生成，再將0.4 g（約1 mmo1）硫酸鐵加入到三口燒瓶中，同時滴加約10 mL濃度為0.5 mol/L的醋酸溶液調pH至弱酸性，然后在40℃的恒溫水浴鍋中加熱回流攪拌4 h，即得到大量棕黑色沉淀，靜置、冷卻、抽濾，沉淀用95%乙醇洗滌數次，室溫真空干燥，最后得深棕色粉末狀固體，保存備用。

1.2.2 蘆丁合鐵組成與結構的表征 配位比的測定采用等摩爾連續變化法：固定緩沖溶液的用量為2.0 mL，金屬離子和蘆丁溶液（濃度均為1.0 mmol/L）的總量為8.0 mL，連續改變兩種組分的體積，在40℃的恒溫水浴鍋中反應1 h，反應完畢后測溶液在416 nm處的吸光度，并對蘆丁體積作圖。

紫外吸收光譜測定：選擇合適的參比溶液，在200～700 nm范圍掃描樣品溶液的紫外可見吸收光譜圖。掃描速度為500 nm/min，分辨率為0.02 nm。

差熱-熱重分析測定：取3.6 mg蘆丁合鐵放入CRY-2P型差熱分析儀中，在N2氣氛中，升溫速度為20℃/min，測定范圍為20～700℃ 條件下，繪制其TG-DTA-DTG曲線圖。

紅外光譜測定：KBr壓片，在400～4000 cm-1區間范圍內掃描其紅外光譜。

1.2.3 蘆丁合鐵與DNA作用的光譜表征 熒光光譜測定：在10 mL比色管中加入26.7 mg/25 mL DNA溶液0.05 mL，1.0 mg/mL EB溶液0.4 mL，再分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的蘆丁合鐵（36.7 mg/50 mL），用二次蒸餾水稀釋至刻度，避光作用1 h后，在激發波長為356 nm、激發狹縫和發射狹縫為10 nm的條件下掃描其發射光譜。

2 結果與分析

2.1 蘆丁合鐵組成的測定

圖1即為用等摩爾連續變化法測配位比的曲線。由圖1可見，當Ru和Fe（Ⅲ）體積比（即摩爾比）約為2∶1時吸光度最大，說明蘆丁合鐵配合物的組成約為Ru∶Fe（Ⅲ）=2∶1。

圖2為蘆丁合鐵的TG-DTA-DTG曲線圖，由圖2可見，熱重曲線在開始時也有由于氣流不穩所致的鼓起部分，在54℃左右有一吸熱峰，是由于蘆丁合鐵配合物失去結晶水所致，對應于熱失重曲線，失重率為6.94%，推測結晶水分子數為5；在261℃處有一吸熱峰，為配合物的分子結構被破壞而引起分解所致，對應于熱失重曲線，失重率為18.33%，最后剩余81.67%可能為未完全分解的蘆丁和Fe2O3的質量。

圖1 蘆丁合鐵配位比的測定

結合以上配位比組成的測定和差熱與熱重分析的數據，可以推測出合成的蘆丁合鐵配合物分子式可能為Fe（Rutin）2·5H2O。

圖2 蘆丁合鐵的TG-DTA-DTG曲線

2.2 紫外-可見光譜分析

分別稱取0.0260 g蘆丁、0.0367 g蘆丁合鐵，用95%乙醇定容至100 mL。用95%乙醇作參比，在200～700 nm范圍掃描其吸收光譜，光譜圖見圖3所示。

圖3 蘆丁及其配合物在95%乙醇溶液中的紫外吸收光譜圖

蘆丁在乙醇溶液中的特征吸收波長為258 nm、360 nm，形成配合物后兩個峰帶分別紅移了4 nm和56 nm。譜帶的移動證明了配合物的生成，而譜帶之所以移動是因為形成配合物之后，整個分子中電子的離域程度增大，致使電子躍遷時需要的能量降低，從而使吸收峰發生紅移。

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜是由于分子中基團原子間振動躍遷時吸收紅外光所產生的，紅外光譜主要用于定性鑒定和結構分析。表1為蘆丁及其配合物的紅外光譜數據，配體蘆丁在1655 cm-1處出現羰基伸縮振動吸收峰，蘆丁合鐵形成配合物后向低頻方向移動了約31 cm-1，表明蘆丁4位羰基參與了配合反應。蘆丁合鐵在620.94 cm-1處出現了Fe-O鍵的特征吸收峰，而該吸收峰在蘆丁的紅外波譜圖中沒有出現，可見金屬離子與配體發生了絡合。蘆丁在1504.76 cm-1處出現的峰為苯環π鍵共軛體系的（C=C）鍵伸縮振動峰，在配合物中此峰向低波數移動了30.43 cm-1，這是配位反應對苯環共軛體系影響所致。另外，蘆丁在1298.10 cm-1處的C-O伸縮振動移至1271.21 cm-1，這些現象也說明由于金屬離子的配位作用發生偏移，從而產生吸收峰的位移。

表1 紅外光譜數據/cm-1

2.4 配合物與DNA作用的電子吸收光譜分析

在10 mL比色管中加入27.8 mg/50 mL蘆丁合鐵2 mL，再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的26.7 mg/25 mL DNA溶液，用二次蒸餾水稀釋至刻度，掃描紀錄紫外光譜（見圖4）。從圖4中看出DNA的加入使蘆丁合鐵配合物的吸收光譜發生了變化，隨著DNA濃度的增加，譜圖有明顯的增色效應，吸收峰的位置紅移了10 nm左右，紅移是由蘆丁合鐵分子嵌入DNA雙鏈中，蘆丁合鐵的π*共軛體系與DNA堿基的大π共軛體系之間發生較強的相互作用，產生π電子堆積，其π*空軌道與堿基的π電子軌道發生偶合，能使級下降，導致π*—π躍遷能減?。?0］。這說明蘆丁合鐵與DNA確實發生了作用。

2.5 配合物與EB的競爭性結合研究

圖4 蘆丁合鐵及其與DNA作用后的吸收光譜

EB是一種熒光試劑，它本身的熒光很弱，但嵌入雙鏈DNA的堿基之間后使本身熒光強度顯著增強。如果小分子配合物也能與DNA發生類似的嵌入作用，則這個小分子競爭EB與DNA的結合位點，使體系的熒光強度減弱。通常，當EB-DNA體系的熒光強度減弱50%，且c（配合物）/c（DNA）＜100時，就認為該小分子配合物與DNA發生了類似于EB的嵌入作用［11］。

圖5即為加入不同量的蘆丁合鐵后EB-DNA的熒光光譜。由圖5可知，當c（蘆丁合鐵）/c（DNA）=5.50時，EB-DNA體系的熒光強度已降到原來的50%以下，說明蘆丁合鐵發生了類似于EB的嵌入作用。隨著蘆丁合鐵的加入，它取代了EB-DNA體系中相當數量的EB分子，導致了EB-DNA體系熒光強度的較大降低。

圖5 蘆丁合鐵-EB-DNA體系的熒光光譜

2.6 熒光猝滅方式判斷

根據經典的熒光猝滅理論，無論靜態猝滅或動態猝滅，體系相對熒光強度F0/F（F0為未加入配合物的EB-DNA體系熒光值，F為加入配合物的EB-DNA體系的熒光值），對配合物濃度［Q］作圖均應得到一條直線［12］（見圖6）。由圖6可知熒光強度F0/F與配合物濃度呈線性關系，根據Stem-Volmer方程F0/F=l+kq[Q]，得出蘆丁合鐵與DNA的鍵合常數為67.57 mL/mg，相關系數R=0.9923，說明蘆丁合鐵嵌入DNA雙鏈中取代已嵌入的EB分子。

圖6 蘆丁合鐵對EB-DNA體系的熒光猝滅

3 結語

筆者合成了蘆丁合鐵配合物，結合UV中的等摩爾連續變化法和TG-DTA等手段初步確定其可能的分子式為Fe（Rutin）2·5H2O，并對配合物的結構進行了表征；運用吸收光譜、熒光發射光譜等方法研究了配合物與DNA的作用機理，并計算出鍵合常數為67.57 mL/mg。實驗結果表明蘆丁合鐵與DNA以嵌入模式結合。

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