GSTM1基因多態性與肺癌相關性研究

暨南大學醫學院第三附屬醫院 廣東省珠海市人民醫院（519000）陸奇凱

肺癌是環境和遺傳因素相互作用的多因素、多階段惡性腫瘤性疾病[1]。肺癌是當前癌癥死亡的主要病因之一，其死亡率增加和吸煙密切相關[2]。近年來，隨著分子生物學技術的突飛猛進和分子流行病學的發展，肺癌相關遺傳因素的研究越來越受到重視，陸續發現了可能致病的相關基因[3]。

體外實驗研究表明，GSTM1編碼缺失基因導致致癌物在體內的代謝障礙可能是肺癌發生過程中的一個重要環節，提高了患肺癌的風險。此外，GSTM1基因可影響煙草中含有的一種亞硝胺化合物——4-甲基亞硝胺-1（3-吡啶）-丁酮所誘導的遺傳毒性作用及其并發的與吸煙相關的健康效應。本研究通過對GSTM1基因多態性與環境暴露因素和肺癌易感性關系進行研究，為探索肺癌的發病機制及其診斷、防治提供理論依據。為吸煙、不良的生活習慣、職業暴露因素等可增加肺癌的罹患率提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 研究對象 肺癌病例來源于2005年9月～2011年7月期間在廣東省珠海市人民醫院經影像學檢查，痰脫落細胞，支氣管沖洗液中找到癌細胞，外科手術切除并經病理學確診的91例原發性肺癌患者為研究對象。按肺癌的TNM分期分類。對照組138例是來自于上述醫院的健康體檢人員。

1.2 實驗方法

1.2.1 血液標本收集 空腹采集研究對象（病例/對照）的外周靜脈血5ml，所收集的血樣立即送試驗室分離白細胞和血清，分別裝入塑料離心管中放在-20℃冰箱中保存備用，血清備用，血細胞用于提取DNA。

1.2.2 改良酚-氯仿法提取血液基因組DNA

1.2.3 采用PCR–RFLP技術檢測GSTM1基因多態性 引物設計：兩對引物（見附表1）分別特異性擴增GSTM1基因片斷（215bp）及參照基因β-globin（β-珠蛋白、268bp）。引物由上海生物工程公司合成。

反應體系：以β球蛋白（β-Globin）為內對照，PCR反應體系（25μl）：Buffer 2.5μl，25mM/L的MgCl22.0μl，10mM/L的dNTPs 0.5μl，20μM/L的GSTM1引物各0.3μl，內對照引物各0.2μl，DNA模板200ng（2μl），Taq酶1.5U（0.3μl），補雙蒸水至25μl。

反應條件為：開始94℃預變性5min，進入熱循環94℃50s、59℃退火50s、72℃50s，共35個循環，最后72℃延伸10min。

取10μl PCR產物于1.8%瓊脂糖凝膠水平電泳30min（電壓125V），0.5μg/ml的EB染色，ZF型紫外分析儀上觀察結果。

1.2.4 統計學方法 計數資料使用χ2檢驗。用Logistic回歸法篩選疾病預后的有關因素，檢驗水準設為a＝0.10，其余以P＜0.05為統計學有意義。統計學分析均使用SPSS13.0軟件。

2 結果

2.1 多態性結果擴增產物如果有215bp和268bp兩條帶，為GSTM1基因功能型，如果僅有一條268bp條帶則為GSTM1基因缺失型。

2.2 GSTM1與肺癌的關系 GSTM1基因缺失在肺癌組和對照組中的頻率分別為67.0%（61/91）和50.7%（70/138），兩組差異無統計學意義（P＞0.05），見附表2。

2.3 吸煙、GSTM1與肺癌關系 將病例和對照分為吸煙和不吸煙兩組，在吸煙組中，GSTM1基因多態性在病例組和對照組間的差異沒有統計學意義；而在不吸煙組中，GSTM1基因多態性在病例組和對照組間的差異有統計學意義，見附表3。

2.4 肺癌類型、GSTM1與肺癌關系 將病例組分為腺癌和鱗癌兩類，發現肺癌病理組織學類型與GSTM1基因多態性差異無統計學意義，見附表4。

2.5 運用Logistic回歸評價各影響因素與肺癌的關系 在91例原發性肺癌患者中，以文化程度、吸煙、吸煙量、戒煙、開始吸煙時間、家內吸煙者、工作環境吸煙者、家庭有無排氣扇、家庭有無抽油煙機、食動物油、常吃豆類制品、常吃蔬菜、常吃胡蘿卜、常吃水果、常吃肉類、飲酒、飲茶、體育鍛煉、有無長期精神壓抑、直系親屬癌癥史及GSTM1基因多態情況作自變量，以肺癌患病率為因變量，經多變量logistic回歸分析，用向前法篩選變量，引入變量的檢驗水準為a＝0.10。所研究的22個相關因素中，入選模型GSTM1基因多態、吸煙、飲酒、精神調節能力、長期精神壓抑、家庭有無抽油煙機、有無直系親屬肺癌史等因素與肺癌發病有關聯，其OR值分別為：1.77、2.34、2.67、1.53、1.83、3.27、3.29，是影響肺癌患病率的危險因素。

附表1 GSTM1基因及β-globin基因擴增引物序列

附表2 GSTM1基因缺失與肺癌相對危險性分析

附表3 吸煙狀況及GSTM1基因缺失與肺癌的關系

附表4 肺癌病理組織學類型與GSTM1的關系

3 討論

谷胱苷肽硫轉移酶M1（GSTM1）是谷胱苷肽硫轉移酶超基因家族中Mu家族的成員之一，GSTMl主要催化谷光苷肽與環氧化物及多環芳烴（苯并芘）的羥基代謝產物等，能解毒代謝產物使其形成親水性物質而排出體外[4][5]，GSTM1等位基因純合缺失，該基因型為GSTM1基因缺失型；GSTM1等位基因無缺失或雜合性缺失，該基因型為GSTM1基因功能型。若個體為GSTM1基因缺失型，則其體內沒有GSTM1酶的表達。1990年首次報道GSTM1基因缺失與肺癌發生有密切關系后[6]。國內外對此進行了大量研究，其結果不一。在本研究結果中，GSTM1基因缺失率在病例組和對照組的差異無統計學意義。

部分人存在的GSTM1缺失型是造成人群GSTM1基因多態的原因，編碼該酶的等位基因純合缺失可導致體內不能產生有活性的酶蛋白，使得致癌物在體內蓄積，機體的化學解毒能力下降，對癌癥的易感性增加[7][8]，尤其增加了吸煙相關性肺癌發生的危險性，并與肺鱗癌的危險性顯著增高[9]。Cabral等[10]對基因改變與肺癌易感性關系的研究結論相類似。筆者的研究將吸煙和不吸煙分為病例組和對照組，在吸煙組中，GSTM1基因缺失在兩組間的差異沒有統計學意義；而在不吸煙組中，GSTM1基因缺失在兩組間的差異有統計學意義。杜國波等[11]對川北地區125例肺癌患者和125例非肺癌患者GSTM1基因多態性研究發現，GSTM1基因缺失型與肺癌類型無明確關系。

目前國內外對吸煙、GSTM1、肺癌類型等相關因素與罹患肺癌危險性關系的研究結果也不一致，因此在分析GSTM1基因與肺癌的關系時，應結合其他的環境暴露來進行才能真正揭示其在肺癌發生中的作用。

筆者所研究的22個相關因素中，入選模型GSTM1基因多態、吸煙、飲酒、精神調節能力、長期精神壓抑、家庭有無抽油煙機、有無直系親屬肺癌史等因素與肺癌發病有關聯，是影響肺癌患病率的危險因素。祝小霞[12]等報道烹調油煙暴露是非吸煙女性肺癌的危險因素，CYP1A1 MspI基因多態性與烹調油煙聯合作用可增加肺癌發病的風險，這也說明肺癌本身遺傳易感性機制十分復雜，不同種族和地區的環境暴露也是造成不同人群易感性的明顯差異的重要原因之一。因此，深入研究GSTM1基因缺失型與環境暴露因素和遺產易感性的交互作用在肺癌發病中的影響，發現并保護易感人群，對降低肺癌發病率具有重要的意義。