清音丸改劑型前后對免疫低下模型小鼠作用的比較研究

北京市藥品檢驗所（100035）李雪梅 周建平 胡宇馳

清音丸主要由訶子肉、川貝母、百藥煎、烏梅肉、葛根、茯苓、甘草、天花粉以上入味，粉碎成細粉，過篩，混勻。每100g粉末用煉蜜40～50g加適量的水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加煉蜜110～130g制成大蜜丸，即得。具有清熱利咽，生津潤燥的功效，主要用于治療肺熱津虧導(dǎo)致的咽喉不利、口舌干燥、聲啞失音。清音片是在清音丸原劑型—水蜜丸、大蜜丸的基礎(chǔ)上改變劑型而成，產(chǎn)品提取率為2.5g生藥/g清音片藥粉，制成片劑。清音片擬定具有與原劑型清音丸相同的功能主治，其臨床使用量與清音片相同（折合生藥量）。我中心深入研究了清音丸、片對免疫系統(tǒng)功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料

1.1 藥品 本試驗用清音片藥粉（批號：100217，產(chǎn)品提取率為2.5g生藥提取1g清音片）、清音丸蜜丸藥粉（批號：100215）均由北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所提供；參芪顆粒（批號：20100302)，江西山高制藥有限公司；清喉利咽顆粒（批號：100902），天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠；布洛芬片（批號：20100106），北京太平洋藥業(yè)有限公司。

1.2 動物 SD大鼠，ICR小鼠，均為SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0006號。

1.3 試劑 伊文思蘭（批號：871225），中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站；丙酮（批號：20100615），北京化工廠；注射用環(huán)磷酰胺（批號：10070821），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.4 儀器 TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 方法[1][2]

2.1 對免疫功能低下小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（小鼠碳粒廓清法） ICR小鼠，雌雄各半，體重18～20g，按體重隨機分成9組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、清音丸、清音片大、中、小劑量組（按生藥量計，0.910g/kg，0.455g/kg，0.228g/kg），參芪顆粒陽性對照組（1g/kg），每天Ig給藥，連續(xù)給藥14d。除空白對照組外，其余各組分別于給藥后第8d、10d給予每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，造成小鼠免疫功能低下模型，于末次給藥后1h，給予每只小鼠尾靜脈注射印度墨汁10mL/kg，注射后1min、5min分別從小鼠眼靜脈叢取血20μL，溶于0.1%Na2CO3溶液中搖勻，在680nm處測定吸光度（A），最后將小鼠頸椎脫臼處死，分別稱取肝脾重量。按下列公式計算廓清指數(shù)（K）和校正廓清指數(shù)（a），×體重/（肝重+脾重）。

2.2 對二硝基氯苯致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗 ICR小鼠96只，雌雄各半，體重18～20g，按體重隨機分成8組，每組12只，分別為空白對照組，清音丸、清音片大、中、小劑量組（按生藥量計，0.910g/kg，0.455g/kg，0.228g/kg），參芪顆粒陽性對照組（1g/kg）。試驗前一天用刀片對小鼠腹部進行脫毛，第二天將50%DNCB丙酮溶液2μL/只涂于小鼠腹部脫毛區(qū)進行致敏，致敏后按20mL/kg開始給藥，對照組給予同體積去離子水。連續(xù)給藥12d后，于小鼠腹部脫毛區(qū)涂2.5%DNCB丙酮溶液20μL/只進行攻擊。24h后，每鼠尾靜脈注射1%伊文思蘭10mL/kg。30min后處死小鼠，取下腹部藍染皮膚，剪碎，置試管中，用1∶1丙酮生理鹽水混合液4mL浸泡24h后，離心取上清液，于610nm處測定吸光度（A），各組進行比較。

2.3 對免疫功能低下小鼠血清溶血素形成的影響（溶血素法） ICR小鼠108只，雌雄各半，體重18～20g，按體重隨機分成9組，每組12只，分別為空白對照組，模型對照組，清音丸、清音片大、中、小劑量組（按生藥量計，0.910g/kg，0.455g/kg，0.228g/kg），參芪顆粒陽性對照組（1g/kg），按20mL/kg每天Ig給藥，連續(xù)給藥14d。給藥后第7d，各組動物按0.2mL/只腹腔注射5%雞紅細胞生理鹽水混懸液進行免疫。除空白對照組外，其余各組分別于給藥后第8d、10d，給每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，造成小鼠免疫功能低下模型。并于免疫后第6d，各組動物取血，將血清稀釋1倍（稀釋血清）。取稀釋血清0.25mL，與5%雞紅細胞0.125mL、10%豚鼠血清（補體）0.125mL作用后，在37℃恒溫箱中保溫30min后，0℃冰箱終止反應(yīng)后離心，取上清液于540nm處測定吸光度（A），各組進行比較。

3 結(jié)果

3.1 清音片對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（小鼠碳粒廓清法） 對腹腔注射環(huán)磷酰胺造成免疫低下模型小鼠Ig清音片，在0.910g生藥/kg劑量下，碳粒廓清指數(shù)與模型對照組比較有顯著性意義，提示清音片能增強小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)單核巨噬細胞的吞噬功能，即能增強小鼠免疫功能[3]。而清音丸對小鼠廓清指數(shù)則未見明顯影響，結(jié)果見附表1。

3.2 清音片對二硝基氯苯致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗 試驗結(jié)果表明：小鼠口服清音丸、清音片，對DNCB致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)無明顯影響作用。但從吸光度值上看，清音丸、清音片吸光度值較空白對照組較高，且清音丸組吸光度值較清音片組較高，由此推斷如給藥劑量增加，可能會增強細胞免疫的作用[3][4]，結(jié)果見附表2。

3.3 清音片對免疫低下小鼠血清溶血素形成的影響（溶血素法） 試驗結(jié)果表明：給藥14d后，在0.910g生藥/kg劑量下，清音片能明顯增加免疫低下模型小鼠血清抗原抗體反應(yīng)量，其血清反應(yīng)的吸光度值與模型對照組比較差異有顯著性意義。由此可見，對腹腔注射環(huán)磷酰胺造成免疫低下模型小鼠，清音片對雞紅細胞所致小鼠特異性抗體生成有明顯促進作用，反映清音片具有一定增強體液免疫的作用[3]，結(jié)果見附表3。

4 討論

清音片是在清音丸的基礎(chǔ)上改變劑型而成。本方中訶子肉斂肺，澀腸，下氣。川貝母潤肺散結(jié)，止咳化痰。百藥煎潤肺化痰，生津止渴。烏梅肉收斂生津，安蛔驅(qū)蟲。葛根解表退熱，生津透疹，升陽止瀉。茯苓利水滲濕，健脾寧心。甘草補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和藥性。天花粉清熱生津，消腫排膿。多藥并用，共奏清熱利咽、生津潤燥之效?，F(xiàn)代臨床主要用于治療慢性咽炎[3]。

機體免疫系統(tǒng)是由非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫共同構(gòu)成。機體免疫功能低下可致感染、腫瘤等多種疾病。文獻報道，清音丸在2g/kg劑量時具有增強小鼠非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫，增強機體免疫功能對治療慢性咽炎具有一定作用[3]。

附表1 清音片對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

附表1 清音片對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響（ ±s，n=10）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型對照組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別 給藥劑量（g/kg） 廓清指數(shù)（k） 校正廓清指數(shù)（a）空白對照 - 0.09±0.022) 6.36±0.88模型 - 0.05±0.02 5.94±1.39清音片0.910 0.09±0.022) 6.82±0.71 0.455 0.06±0.01 6.31±0.90 0.228 0.06±0.01 6.36±0.70 0.910 0.06±0.01 7.02±0.96 0.455 0.06±0.04 6.01±1.62 0.228 0.08±0.02 7.07±0.71參芪顆粒 1 0.09±0.032) 7.44±1.083)清音丸

附表2 清音片對DNCB致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗（ ±s，n=12）

附表2 清音片對DNCB致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響試驗（ ±s，n=12）

注：與空白對照組比較， 1）P＜0.05；與模型對照組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別 給藥劑量（g/kg） 吸光度值（Abs）空白對照 - 0.44±0.18清音片0.910 0.53±0.22 0.455 0.45±0.13 0.228 0.45±0.14 0.910 0.58±0.13 0.455 0.52±0.13 0.228 0.47±0.22參芪顆粒 1 0.66±0.191)清音丸

附表3 清音丸、清音片對小鼠血清溶血素形成的影響（ ±s，n=12）

附表3 清音丸、清音片對小鼠血清溶血素形成的影響（ ±s，n=12）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型對照組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別 給藥劑量（g/kg） 吸光度值（Abs）空白對照 - 0.60±0.103)模型對照 - 0.36±0.08清音片0.910 0.51±0.102)0.455 0.41±0.11 0.228 0.30±0.11 0.910 0.49±0.122)0.455 0.38±0.17 0.228 0.36±0.11參芪顆粒 1 0.58±0.143)清音丸

本文主要從對免疫系統(tǒng)功能作用影響方面比較了清音片和清音丸的主要藥效作用。對腹腔注射環(huán)磷酰胺造成免疫低下的小鼠，在非特異性免疫功能試驗中，吞噬指數(shù)K反映網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，吞噬活性a則反映單核巨噬細胞的吞噬能力。

試驗結(jié)果表明，清音片非特異性免疫功能作用效果優(yōu)于清音丸；在二硝基氯苯致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗中，二硝基氯苯是小分子半抗原，將其涂于皮膚上，可透過上皮與角質(zhì)蛋白及膠原蛋白結(jié)合成全抗原，并刺激T淋巴細胞轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細胞，分布于全身皮膚內(nèi)。以二硝基氯苯攻擊，即可見攻擊部位形成遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)。試驗結(jié)果表明，清音片、清音丸沒有增強細胞免疫的作用。血清溶血素的測定主要反映抗體形成的數(shù)量，也提示合成抗體的能力，是反映體液免疫的重要指標(biāo)。在血清溶血素試驗中，清音丸和清音片以0.910g/kg劑量下都有增強免疫的作用。

綜上所述，清音丸由蜜丸改成片劑后，在本試驗劑量和試驗條件下具有增強體液免疫和非特異性免疫功能的作用。