MMI-166對人胰腺癌SW1990細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響

高崇崇 鞏本剛 夏修良 宋德坤 徐懷勇

·論著·

MMI-166對人胰腺癌SW1990細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響

高崇崇 鞏本剛 夏修良 宋德坤 徐懷勇

目的觀察MMI-166對人胰腺癌SW1990細胞及其移植瘤組織凋亡相關蛋白表達的影響，探討其可能機制。方法應用人胰腺癌細胞株SW1990建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，按完全隨機法將荷瘤裸鼠分為對照組和MMI-166組，分別給予口服生理鹽水和MMI-166(200 mg·kg-1·d-1)，持續28 d。采用TUNEL法和蛋白質印跡法檢測移植瘤組織的細胞凋亡指數(AI)及p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas蛋白的表達。應用不同濃度(0、50、100 μg/ml)MMI-166作用于人胰腺癌SW1990細胞24 h，蛋白質印跡法檢測c-Myc、Survivin的表達。結果MMI-166組移植瘤組織的AI為81.1±7.9，顯著高于對照組的21.3±2.2(P=0.000)；c-Myc、Survivin的表達量分別為7715±2229、4594±1240，顯著低于對照組的16870±2446、15208±1903(P值均為0.000)；p53、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas的表達與對照組比較無顯著變化。50、100 μg/ml的MMI-166處理后，人胰腺癌SW1990細胞的c-Myc表達量顯著下調(0.098±0.003、0.073±0.008比0.169±0.007，F=189.361，P<0.05)；Survivin的表達量無明顯變化。結論MMI-166可能通過下調c-Myc的表達誘導人胰腺癌SW1990細胞凋亡。

胰腺腫瘤； MMI-166； 金屬蛋白酶類組織抑制劑； 細胞凋亡

細胞凋亡減少已被證實是多種腫瘤致病機制之一[1]，研究細胞凋亡的調節機制對于人們認識腫瘤發病機制及新的防治方法具有重要意義。MMI-166是第三代新型基質金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑，可選擇性抑制MMP-2、MMP-9的活性。我們前期的實驗證實，MMI-166在體外呈濃度及時間依賴性促進人胰腺癌SW1990細胞凋亡[2]。本研究進一步通過體內實驗觀察MMI-166對凋亡相關蛋白表達及細胞凋亡的影響，并通過體外實驗探討MMI-166與c-Myc、Survivin表達的量效關系。

材料與方法

一、人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

BALB/c裸鼠20只，4～5周齡，雄性，體重18～22 g，購自上海斯萊克動物中心，在無特定病原體動物(SPF)條件下飼養。人胰腺癌SW1990細胞株購自上海細胞庫，常規培養、傳代。取對數生長期細胞，用無血清L-15培養基調整細胞濃度，按1×107/只密度接種于裸鼠背部皮下。約7 d后裸鼠背部均有移植瘤生長，成瘤率100%。按完全隨機法將裸鼠分成對照組及MMI-166組。對照組裸鼠口服生理鹽水，MMI-166組裸鼠口服MMI-166 200 mg·kg-1·d-1(日本SHIONOGI公司免費提供)，連服28 d。實驗結束處死裸鼠，取移植瘤標本，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續切片。

二、免疫組織化學染色檢測p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas蛋白

p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas抗體均購自福州邁新公司，二抗購自PAKD公司，每種抗體重復檢測3次。隨機取10個100倍視野，應用Image-pro Plus6.0軟件計算吸光值，取均值表示蛋白表達量。

三、細胞凋亡指數(AI)檢測

采用TUNEL法檢測凋亡細胞，試劑盒購自德國羅氏公司，按說明書操作。細胞核中出現深棕色為凋亡細胞。每例切片至少計數10個400倍視野，以平均每1000個細胞中的凋亡細胞百分數為AI值。每次實驗均設陰性對照片(即加不含TdT酶的反應液)和陽性對照片(DNA內切酶預處理過的組織切片)。

四、c-Myc、Survivin蛋白表達檢測

應用0、50、100 μg/ml的MMI-166處理SWl990細胞24 h，收集細胞，應用細胞裂解液裂解。蛋白定量后常規行蛋白質印跡法檢測c-Myc、Survivin表達，以GAPDH作為內參，應用ImageJ軟件分析。以目的條帶與內參條帶灰度比值表示蛋白表達量。

五、統計學處理

結 果

一、裸鼠移植瘤組織的凋亡指數

凋亡細胞的胞核呈深棕色，染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解。凋亡細胞呈單個散在分布和(或)簇狀分布(圖1)。MMI-166組移植瘤的AI為81.1±7.9，顯著高于對照組的21.3±2.2(P=0.000)。

圖1對照組(a)及MMI-166組(b)的凋亡細胞(TUNEL法 ×100)

二、裸鼠移植瘤p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas的表達

Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1定位于細胞質，p53定位于細胞核，Fas定位于細胞膜，c-Myc定位于細胞核與細胞質。MMI-166組移植瘤組織c-Myc、Survivin蛋白表達顯著低于對照組(P值均<0.01)，而p53、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas表達與對照組均無統計學意義(圖2、表1)。裸鼠移植瘤組織c-Myc、Survivin表達與細胞凋亡呈顯著負相關關系(r=-0.858，r=-0.939；P=0.000)。

圖2對照組(上)及MMI-166組(下)移植瘤組織c-Myc(a)、Survivin(b)、p53(c)、Fas(d)、Bax(e)、Bcl-2(f)及Caspase-1(g)蛋白表達(EnVision×100)

表1 兩組胰腺癌移植瘤c-Myc、Survivin、p53、Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-1蛋白表達及

三、SW1990細胞c-Myc、Survivin蛋白的表達

對照組SW1990細胞的c-Myc、Survivin蛋白表達量分別為0.169±0.007和0.391±0.006。50、100 μg/ml的MMI-166處理SW1990細胞24 h后，c-Myc表達量分別為0.098±0.003、0.073±0.008，隨著藥物濃度增加表達量逐漸減少，組間差異有統計學意義(F=189.361，P<0.05)；Survivin表達量分別為0.395±0.006、0.382±0.004，各組間差異無統計學意義(F=4.328,P>0．05,圖3)。

1：對照組，2：50 μg/ml MMI-166處理組；3．100 μg/ml MMI-166處理組

圖3各組SW1990細胞的c-Myc、Survivin表達

討 論

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡(PCD)，是多細胞生物體內一種由生化調控引起的細胞自殺形式，它在組織分化、器官形成和抵御疾病方面起著重要的作用。細胞凋亡的途徑主要有兩條，一條是通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶caspase，一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內的重要蛋白降解，引起細胞凋亡。細胞凋亡的調控涉及許多基因，包括一些與細胞增殖和凋亡有關的原癌基因和抑癌基因，其中研究較多的有p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas等。本研究結果顯示，MMI-166處理組移植瘤的細胞凋亡指數顯著高于對照組，表明MMI-166在體內具有促進細胞凋亡的作用。

文獻報道，c-Myc是一類“快速早期反應”的細胞內信使，其表達使細胞進入細胞周期，在某些生長因子的刺激下促使細胞增殖[3]。李勝等[4]研究發現，原發胰腺癌和胰腺癌轉移瘤組織中c-Myc的表達明顯高于胰腺良性病變組織。Orian等[5]研究了62例腦星形細胞瘤，發現低、中、高度惡性腫瘤組織的c-Myc蛋白過表達率分別為5%、33%和76%，差異具有統計學意義。他們認為c-Myc蛋白高表達意味著有相當高比例的細胞處于增殖狀態，而凋亡受抑制是腫瘤進展的重要指標，患者預后極差。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)中分子質量最小和最具有基礎與臨床意義而倍受關注的分子。Sarela等[6]報道，52例胰腺癌組織的Survivin陽性率為88%，Survivin陽性時凋亡指數低，而凋亡指數低的患者預后明顯差于凋亡指數高的患者。推測細胞凋亡的增加與c-Myc、Survivin的表達下降有關。本研究結果顯示，MMI-166處理人胰腺癌SW1990細胞24 h后c-Myc的表達下調，而Survivin的表達無明顯變化，推測MMI-166促進胰腺癌細胞凋亡與c-Myc基因表達下調有關。Survivin表達雖無明顯變化，但不排除樣本量及蛋白濃度等因素的影響，因此MMI-166對Survivin表達的影響仍需進一步研究。

Meyer等[7]報道，MMP-9和MMP-10保護結腸腺癌細胞免于PKC/p53誘導的凋亡。Chetty等[8]報道，MMP-2可以通過改變Bax/Bcl-2表達，誘導Caspase-3、8、9以及PARP-1分裂體形成，誘導Fas/FasL的活化等途徑抑制肺腺癌細胞的凋亡。由于MMI-166抑制MMP-2、MMP-9的活性[9]，提示MMI-166可能通過抑制MMP-2、9表達而下調c-Myc的表達，從而促進胰腺癌細胞凋亡，但其具體機制待進一步研究。

[1] Kerr JF，Winterford CM，Harmon BV， et al. Apoptosis: its signficance in cancer and cancer therapy.Cancer,1994,73: 2013-2026.

[2] 鞏本剛，徐懷勇，成丕光，等.MMI-166對人胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響.中華胰腺病雜志，2012，12：100-102.

[3] Dang CV,Resar LM，Emison E,et al．Function of the c-Myc oncogenic transcription factor．Exp Cell Res,1999，253：63-77.

[4] 李勝，石學濤，張鑫，等.胰腺癌中bcl-2的表達與細胞凋亡及癌基因c-myc表達的關系.肝膽胰外科雜志，2001,13：204-207.

[5] Orian JM，Vasilopoulos K，Yoshida S，et al.Overexpression of multiple oncogenes related to histological grade of astrocytic glioma．Br J Cancer，1992，66：106-112.

[6] Sarela AI，Verbeke CS，Ramsdale J，et al.Expression of survivin,a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein,in pancreatic adenocarcinoma.Br J Cancer, 2002,86：886-892.

[7] Meyer E，Vollmer JY，Bovey R，et al.Matrix metalloproteinases 9 and 10 inhibit protein kinase C-potentiated，p53-mediated apoptosis. Cancer Res，2005，65：4261-4272．

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(本文編輯：呂芳萍)

EffectsofMMI-166onapoptosisandapoptosis-relatedproteinexpressioninhumanpancreaticcancerSW1990cells

GAOChong-chong,GONGBen-gang,XIAXiu-liang,SONGDe-kun,XUHuai-yong.

BinzhouMedicalCollege;DepartmentofHepatobiliarySurgery,BinzhouPeople′sHospital,BinzhouMedicalCollege,Binzhou256600,ChinaCorrespongdingauthor:GONGBen-gang,Email：shenglixiyuan@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of MMI-166 on apoptosis and apoptosis-related protein expression of human pancreatic cancer SW1990 cells and its transplanted tumor, and explore possible mechanism.MethodsThe human pancreatic cancer xenograft model was constructed by using human pancreatic cancer SW1990 cells. Tumor-bearing nude mice were randomly divided into control and MMI-166 groups, and they were treated with normal saline or MMI-166 (200 mg·kg-1·d-1) for 28 days. Apoptosis index (AI), p53, c-Myc, Bax, Bcl-2, Survivin, Caspase-1, Fas proteins were detected by deoxynucl-eotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL method) and Western blot. MMI-166 of different concentrations (0, 50, 100 μg/ml) were used to treat human pancreatic cancer SW1990 cell for 24 h. The c-Myc, Survivin proteins expressions were measured by Western blotting.ResultsApoptosis index in MMI-166 group was 81.1±7.9, which was significantly higher than that in control group (21.3±2.2,P=0.000); the expressions of c-Myc, Survivin were 7715±2229, 4594±1240, which were significantly higher than those in control group (16870±2446, 15208±1903,P=0.000); the expressions of p53, Bax, Bcl-2, Caspase-1, Fas were not significantly different from those in control group. After 50, 100 μg/ml MMI-166 treatment, the expression of c-Myc was significantly down-regulated (0.098±0.003, 0.073±0.008vs. 0.169±0.007,F=189.361,P<0.05); and the expression of Survivin was not significantly changed.ConclusionsMMI-166 may induce cell apoptosis of SW1990 by down-regulating the expression of c-Myc.

Pancreatic neoplasm; MMI-166; Tissue inhibitor of metalloproteinases; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.008

濱州市科技發展計劃項目

256600 山東，濱州醫學院臨床學院(高崇崇、宋德坤)；濱州醫學院附屬濱州市人民醫院肝膽外科(鞏本剛、夏修良、徐懷勇)

鞏本剛，Email：shenglixiyuan@163.com

2012-09-13)