沙利度胺治療裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的療效觀察

喬振國 沈佳慶 王超 葉建新 許春芳

·短篇論著·

沙利度胺治療裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的療效觀察

喬振國 沈佳慶 王超 葉建新 許春芳

胰腺癌目前高居癌癥死因的第4位[1]，診斷后中位生存期不到6個月，1年存活率約為12%，5年存活率<5%[2]。胰腺癌確診時多屬晚期，已失去手術機會，因此，針對胰腺癌的藥物研究是目前的熱點之一。沙利度胺(thalidomide，THD) 又名反應停，是谷氨酸的衍生物，具有抗實體腫瘤作用。體外實驗研究證實[3]，沙利度胺可以抑制胰腺癌SW1990細胞的增殖，促進其凋亡。本研究采用腹腔內注射沙利度胺的方法治療人胰腺癌SW1990細胞的裸鼠移植瘤，觀察其對腫瘤生長及其對血管形成的作用，探討其機制。

一、材料與方法

1．裸鼠胰腺癌移植瘤模型的建立及分組：Balb/c小鼠20只，4～5周齡，體重16～18 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。人胰腺癌SWl990細胞株由蘇州大學附屬第一醫院血液研究所友情饋贈。取對數生長期的SW1990細胞，調整密度至1×107/ml。取0.2 ml細胞懸液注射于裸鼠的左前肢腋窩皮下，成瘤后按數字表法隨機分成對照組、沙利度胺組(THD組)、吉西他濱組(GEM組)和聯合(THD+GEM)組。THD組腹腔內注射THD 200 mg·kg-1·d-1，GEM組腹腔內注射GEM 50 mg·kg-1·d-1，聯合組腹腔內同時注射THD及GEM，對照組腹腔內注射等容積生理鹽水，均為每周3次，連續3周。種植后第4周頸椎脫位法處死荷瘤裸鼠，用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=a×b2/2。并稱移植瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%。

2．VEGF mRNA檢測：使用Trizol提取移植瘤組織總RNA，分光光度儀檢測RNA純度后采用RT-PCR法檢測VEGF mRNA表達。VEGF序列上游為5′-GGACAGACAGACAGACACCG-3′，下游為5′-GCACCCAAGACAGCAGAAAG-3′，擴增片段560 bp；內參β-actin上游為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，擴增片段285 bp。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，攝片、掃描，以VEGF條帶與內參條帶灰度比值表示mRNA表達量。實驗重復3次。

3．VEGF蛋白檢測：取新鮮瘤組織，加入RIPA液提取組織總蛋白質，常規行蛋白質印跡法，以β-actin作為內參。鼠抗人VEGF抗體1∶200 稀釋，最后ECL發光，暗盒曝光、顯影和定影，用明基5000掃描儀掃描。以VEGF條帶與內參條帶灰度比值表示蛋白表達量。

4．移植瘤微血管密度(MVD)測定：采用免疫組化法檢測，以CD34單抗為一抗，血管上皮被染成棕色，計數5個視野下的血管數，取均值。

二、結果

1．移植瘤體積、重量及抑瘤率：對照組、THD組、GEM組、聯合組移植瘤體積分別為(1.256±0.128)、(0.898±0.142)、(0.720±0.124)、(0.442±0.117)cm3；抑瘤率分別為(28.3±3.2)%、(38.8±4.2)%、(63.7±6.0)%；瘤重分別為(1.412±0.138)、(1.013±0.096)、(0.864±0.112)、(0.512±0.091)g。THD組及GEM組瘤體積均較對照組減小，瘤重均較對照組降低(P值均<0.05)，聯合組瘤體積及瘤重均較THD組及GEM組顯著下降(P值均<0.05)。

2．移植瘤組織VEGF表達：對照組、THD組、GEM組、聯合組移植瘤組織VEGF mRNA表達量分別為0.89±0.09、0.69±0.08、0.60±0.06、0.34±0.06；VEGF蛋白表達量分別為0.85±0.07、0.65±0.04、0.48±0.06、0.22±0.06。THD組及GEM組瘤組織的表達量均較對照組下降(P值均<0.05)，聯合組瘤組織的表達又均較THD組及GEM組下降(P值均<0.05，圖1、圖2)。

圖1對照組(a)、THD組(b)、GEM組(c)、聯合組(d)移植瘤組織VEGF mRNA表達

圖2對照組(a)、THD組(b)、GEM組(c)、聯合組(d)移植瘤組織VEGF蛋白表達

3．移植瘤組織的MVD：對照組、THD組、GEM組、聯合組移植瘤組織MVD分別為(22.11±3.07)、(15.65±2.54)、(16.97±2.26)、(11.04±2.44)個，THD組及GEM組瘤組織MVD均較對照組減少(P值均<0.05)，聯合組瘤組織MVD又較THD組及GEM組減少(P值均<0.05，圖3)。

圖3對照組(a)、THD組(b)、GEM組(c)、聯合組(d)移植瘤組織的CD34表達(免疫組化 ×400)

討論實體腫瘤的生長及侵襲、轉移有賴于血管的生成[4]。在諸多腫瘤血管生成因子中，VEGF是目前所知的作用最強的因子之一[5]。VEGF能促使內皮細胞分裂增殖，是具有高特異性的血管內皮細胞有絲分裂素，直接參與誘導腫瘤血管生成[6]，并在腫瘤血管生成的各個環節均有重要作用。而MVD與VEGF之間存在一定的關聯性，被認為是判斷腫瘤發展與轉移能力的指標，是影響患者生存的獨立預后因素[7]。因此，通過抑制腫瘤血管生成過程的任何環節將能阻斷腫瘤血供，從而抑制腫瘤組織的發展、擴散和轉移。

Jazieh等[12]應用THD聯合吉西他濱處理非小細胞肺癌，發現聯合用藥不僅能提高療效，且使用THD可減少吉西他濱的劑量以減輕不良反應。本結果發現，THD能抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的生長，并使VEGF表達及MVD減少，這與文獻結果相類似。本結果還發現，THD與吉西他濱的聯合應用能更顯著地抑制VEGF及MVD。因此，THD在實體腫瘤的治療方面有一定應用前景，為胰腺癌的治療研究指出了新的方向。但THD對各種腫瘤的療效并不一致[13]，其抗腫瘤機制、抗瘤范圍及應用條件等尚待進一步研究，其不良反應有待克服。

[1] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2007.CA Cancer J Clin,2007,57:43-66.

[2] Jemal A,Murray T,Samuels A,et al.Cancer Statistics 2003.CA Cancer J Clin,2003,53:5-26.

[3] 沈陽，許春芳. 沙利度胺對人胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響.中華胰腺病雜志，2011，11:404-406.

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[11] 徐曉晶，熊光蘇，李恩林，等. 沙利度胺對人胰腺癌細胞細胞動力學和VEGF表達的影響.胃腸病學，2012，17:417-421.

[12] Jazieh AR, Komrokji R, Gupta A, et al. Phase Ⅱ trial of thalidomide, irinotecan and gemcitabine in chemonaive patients with advanced non-small cell lung cancer. Cancer Invest, 2009, 27:932-936.

[13] Gao S,Yang XJ,Zhang WG.et al.Mechanism of thalidomide to enhance cytotoxicity of temozolomide in U251-MG glioma cells in vitro.Chin Med J(Engl),2009,122:1260-1266.

2012-12-05)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.017

215006 蘇州，蘇州大學附屬第一醫院消化內科

許春芳，Email：xcf601@163.com