5-HT及5-HT2A受體在大鼠急性壞死性胰腺炎腸功能障礙時的表達及機制研究

薛育政 吳燕敏 吳鐵龍 盛穎玥 余利華 曹海燕 楊睛 林剛 陸宇峰 劉宗良 俞憲民 李兆申

5-HT及5-HT2A受體在大鼠急性壞死性胰腺炎腸功能障礙時的表達及機制研究

薛育政 吳燕敏 吳鐵龍 盛穎玥 余利華 曹海燕 楊睛 林剛 陸宇峰 劉宗良 俞憲民 李兆申

人體中約90% 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)存在于胃腸道，其余存在于血小板及中樞神經系統。最近研究表明，攝入的食物到達十二指腸時不僅能刺激膽囊收縮素(CCK)的釋放，同時刺激腸嗜鉻細胞釋放5-HT。5-HT的釋放又反射性激活迷走神經傳入纖維上的相應受體，進而激活腸反射通路，引起腸蠕動增快[1-2]。近年來，5-HT2A受體(5-HT2AR)和5-HT2B受體(5-HT2BR)對胃腸運動的影響越來越受到人們關注。Bertoni等[3]用5-HT2A激活劑成功制造了腸系膜缺血-再灌注損傷小鼠模型，并證實了腸系膜缺血-再灌注損傷可以造成胃腸運動的減弱。

胃腸功能障礙是重癥急性胰腺炎(SAP)常見的并發癥。目前對5-HT及其受體在SAP胃腸功能障礙中的變化及作用機制鮮有報道。本研究檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠血5-HT含量及腸黏膜中5-HT2AR的表達，探討5-HT及5-HT2AR在ANP腸功能障礙中的作用及可能機制。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：SPF級雄性SD大鼠36只，體重(200±20)g，由南通大學醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(蘇，2002-0022)。按完全隨機法將大鼠分為ANP組和假手術組，每組18只。根據文獻[4]，采用膽胰管內注入3.5%牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g體重(Sigma公司)的方法制備ANP模型。假手術組大鼠開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數次后關腹。術后3、6、12 h分批處死6只大鼠。

2．血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量測定：取血分離血清。全自動生化分析儀檢測血淀粉酶、脂肪酶水平， ELISA法測定血5-HT、IL-6含量。

3．小腸推進率測定：制模后2.5 h用含苯酚紅2 mg/ml的生理鹽水1.0 ml給大鼠灌胃，30 min后快速剖腹取出小腸。剪下幽門遠端至闌尾近端的腸管，鋪在紙上，不加任何拖曳牽引，測小腸全長和苯酚紅前沿至幽門遠端的距離。若苯酚紅前沿顯示不清楚，可在疑似處剪開小腸，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液確認(顯示鮮亮的玫紅色)，并需在其前和后各1 cm處再次滴加NaOH溶液驗證，以保證數據的準確性。小腸推進率為苯酚紅推進的小腸長度/小腸全長×100%。

4．腸黏膜5-HT2AR蛋白表達檢測：取6 h點大鼠距屈氏韌帶10 cm的空腸、末端回腸及乙狀結腸組織(約50 mg)，常規提取總蛋白后行蛋白質印跡法檢測5-HT2AR蛋白，以β-actin作為內參。兔抗大鼠5-HT2AR多克隆抗體工作濃度1∶400，羊抗兔Ig-HRP工作濃度1∶500，最后，ECL發光，X線曝光、顯影、定影。

5．腸黏膜5-HT2A蛋白表達檢測：取3、6、12 h點大鼠距屈氏韌帶10 cm的空腸、末端回腸及乙狀結腸組織約5 mm×5 mm大小，常規固定、石蠟包埋、切片，行免疫組化法檢測5-HT2A蛋白表達。抗5-HT2A一抗工作濃度1∶300，辣根過氧化物酶標記的二抗工作濃度1∶500，最后DAB顯色，復染、脫水、封片。胞質呈棕色染色為陽性細胞。每張切片選擇5個高倍鏡視野，應用Leica RX250型圖像分析系統進行定量灰度掃描，Qwin軟件分析，自動計算5-HT2A陽性細胞面積，取均值。

6．胰腺組織病理學檢查：胰腺組織經HE染色后由兩位專業的病理醫師雙盲閱片。每組隨機取3張切片，每張切片隨機選取10個高倍視野，從水腫、感染、出血和壞死4個方面評價胰腺組織損傷的程度。

二、結果

1．大鼠血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量變化：ANP組大鼠血淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量均較同時間點假手術組大鼠顯著升高，差異有統計學意義(P值均<0.05，表1)。

表1 兩組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、5-HT、IL-6含量變化

注：與假手術同時點組比較，aP<0.05

2．大鼠胰腺組織病理學改變：假手術組大鼠胰腺表現為部分間質水腫，少量炎性細胞浸潤，偶可見點狀出血，極少量腺泡細胞壞死。ANP組大鼠3 h時可有明顯的小葉間水腫，散在片狀出血，較多炎性細胞浸潤，部分腺泡細胞變性壞死；6、12 h可見大量炎性細胞浸潤，多處片狀出血，小葉結構破壞，大量腺泡細胞壞死(圖1)。

圖13、6、12 h點(a、b、c)假手術組(上)及ANP組(下)胰腺病理變化(HE ×400)

3．大鼠小腸推進率：ANP組大鼠3 h時的小腸推進率為(24.78±4.25)%，假手術組大鼠為(61.54±9.01)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

4．大鼠腸黏膜中5-HT2AR蛋白的表達：ANP組大鼠6 h時空腸、末端回腸及乙狀結腸黏膜5-HT2AR蛋白表達水平均較假手術組顯著增強(圖2)。

圖2假手術組6 h點大鼠空腸(a)、末端回腸(b)、乙狀結腸(c)及ANP組6 h點大鼠空腸(d)、末端回腸(e)、乙狀結腸(f)黏膜中5-HT2AR蛋白的表達

5．大鼠腸黏膜中5-HT2A蛋白表達：ANP組大鼠3、6、12 h空腸5-HT2A陽性細胞面積分別為(4.85±0.53)、(5.04±0.61)、(4.79±0.56)萬μm2，較假手術組大鼠的(3.46±0.35)、(3.78±0.47)、(3.86±0.43)萬μm2均顯著增多；ANP組末端回腸5-HT2A陽性細胞面積分別為(4.91±0.61)、(4.79±0.53)、(5.16±0.73)萬μm2，較假手術組的(3.67±0.45)、(3.78±0.48)、(3.53±0.38)萬μm2均顯著增多；ANP組乙狀結腸5-HT2A陽性細胞面積分別為(4.79±0.69)、(4.83±0.74)、(4.94±0.82)萬μm2，較假手術組的(3.65±0.44) 、(3.79±0.51)、(3.87±0.59)萬μm2均顯著增多，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖3、4、5)。

圖33、6、12 h點(a、b、c)假手術組(上)及ANP組(下)空腸黏膜中5-HT2A陽性細胞(免疫組化 ×400)

圖43、6、12 h點(a、b、c)假手術組(上)及ANP組(下)回腸黏膜中5-HT2A陽性細胞(免疫組化 ×400)

圖53、6、12 h點(a、b、c)假手術組(上)及ANP組(下)乙狀結腸黏膜中5-HT2A陽性細胞(免疫組化 ×400)

討論腸功能障礙是SAP最常見的并發癥之一，主要表現為腸動力減弱、腸黏膜缺血再灌注性損傷及繼發性腸黏膜通透性增加[5]，一旦發生腸功能障礙，可進一步引起腸源性感染甚至多臟器功能衰竭，最終導致SAP患者病死率增加。臨床發現，及時有效治療SAP患者繼發的腸道功能障礙，可有效降低SAP患者并發癥的發生率及病死率。

夏敏等[6]研究發現，血清中IL-6的水平與急性胰腺炎病情嚴重程度及并發癥的發生率呈顯著正相關。Ito等[7]研究證實，5-HT2AR的激活能增加5-HT誘導平滑肌細胞產生IL-6。本研究結果顯示，ANP組大鼠血清5-HT、IL-6水平較假手術組明顯升高，且隨時間的延長而增加；空腸、末端回腸及乙狀結腸黏膜5-HT2AR及5-HT2A蛋白表達均較假手術組顯著增加，提示腸黏膜組織中5-HT2AR的激活能反射性地引起血清5-HT濃度增加，而血清5-HT的增加可提高血管通透性和促進內皮細胞產生嗜中性粒細胞趨化作用[8-9]，導致繼發性腸黏膜通透性增加及腸黏膜缺血再灌注性損傷，這可能是ANP發生腸功能障礙的機制之一。

[1] Gershon MD. Nerves, reflexes, and the enteric nervous system: pathogenesis of the irritable bowel syndrome. J Clin Gastroenterol, 2005, 39: S184-S193.

[2] Owyang C, Logsdon CD. New insights into neurohormonal regulation of pancreatic secretion. Gastroenterology, 2004, 127: 957-969.

[3] Bertoni S, Ghizzardi P, Cattaruzza F, et al. Evidence for the involvement of 5-HT2Areceptors in mild mesenteric ischemia/reperfusion dysfunctions in mice. Pharmacol Res, 2007, 56 : 550-555.

[4] 薛育政, 劉宗良, 俞憲民,等. 還原型谷胱甘肽對實驗性急性壞死性胰腺炎的治療效果及機制.胰腺病學, 2007, 7: 212-215.

[5] 楊朝暉. 全身炎癥反應綜合征與急性胰腺炎病情的相關分析. 中華消化雜志, 2006, 26: 196-197．

[6] 夏敏，沈美琴，陳衛昌.血清促炎細胞因子水平與急性胰腺炎嚴重程度的相關性研究.中華消化雜志，2011,31:401-404.

[7] Ito T, Ikeda U, Shimpo M, et al. Serotonin increases interleukin-6 synthesis in human vascular smooth muscle cells. Circulation, 2000, 102 : 2522-2527.

[8] Fujie E, Irie K, Uchida Y, et al. Possible role of nitric oxide in 5-hydroxytryptamine-induced increase in vascular permeability in mouse skin. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1994, 350:361-364.

[9] Charles A, Rounds S, Farber HW. Neutrophil chemoattractant production by cultured serotonin-stimulated bovine and human endothelial cells. Am J Physiol, 1991, 261:L133-L139.

2013-02-04)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.015

江蘇省“333工程”科研項目(CAE01101-06)；江蘇省中醫藥局中醫藥科技項目(LZ11127)；無錫巿社會發展項目(CSZ00N1110)

214041，無錫，無錫巿第三人民醫院消化內科(薛育政、吳燕敏、吳鐵龍、盛穎玥、余利華、曹海燕、楊睛、林剛、陸宇峰、劉宗良、俞憲民)；第二軍醫大學長海醫院消化內科(李兆申)

李兆申，Email：zhaoshenli666@126.com