烏鴉果根甲醇提取物的抑真菌作用研究

李興玉，李興奎，林 鑫，李曉翔

（1.云南農業大學基礎與信息工程學院，云南 昆明650201；2.云南農業大學后勤集團，云南 昆明650201）

烏鴉果（Vaccinium fragile Franch）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（VacciniumL.）植物，俗名午飯果、毛葉午飯果、土千年健、千年矮、老鴉泡、老鴉果，在我國主要分布于貴州、四川、云南、西藏東南等地[1，2］，為多年生常綠矮小灌木。全株藥用，有舒筋活絡、祛風濕、鎮痛等作用[3］，在彝族地區廣泛用于治療腰膝酸軟、四肢無力、風濕關節痹痛、半身不遂等癥[4，5］。全株水提物或醇提物具有殺菌或殺蟲作用，同科的部分種曾作為土農藥防治病蟲害[6］。烏鴉果作為食用資源及園林植物資源開發利用均有報道，但其根部提取物對植物病原真菌的抑菌活性目前尚未見報道。

作者就烏鴉果根甲醇提取物對21種植物病原真菌的抑制作用進行了室內活性測定，擬為烏鴉果植物源農藥的開發利用提供理論基礎。

1 實驗

1.1 供試材料

烏鴉果根，2010年2月采于云南大理白族自治州挖色鎮，室溫陰干。

1.2 供試菌種

三七根腐病菌（Fusarium solani）、玉米彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata Boedijn）、水稻立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、玉 米 小 斑病 （Bipolaris maydis）、茶葉輪斑菌（Pestalotiopsis theae）、魔芋枯萎病菌（Fusarium solani Martius）、玉米莖腐病菌（Fusarium graminearum）、康乃馨枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.Dianthi）、煙草枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.Nicotianae）、棉花紅腐病菌（Fusarium moniliforme）、小 麥 根 腐 病 菌 （Bipolaris sorokiniana）、小麥雪腐病菌（Gerlachia nivalis）、小麥紋枯病菌 （Rhizoctonia cerealis）、馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、煙草立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani）、甘蔗黑腐病菌（Ceratocystis adiposum）、蘋果斑點病菌（Alternaria alternate f.sp.Mali）、煙草赤星病菌 （Alternaria alternate）、煙草疫霉病菌（Phytophthora parasitica）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）。所有菌株均來自云南農業大學植物病理重點實驗室。

1.3 烏鴉果根甲醇提取物的制備

取干燥烏鴉果根1000g，粉碎后用9BV 70% 甲醇在65℃下回流提取3次（第1次2h、第2次1h、第3次1h），合并提取液經真空旋轉蒸發儀在65℃下蒸干[7］，獲得浸膏263g，提取率26.3%。將浸膏混懸于溫水中，用等體積石油醚萃取3次，經預實驗表明石油醚萃取物沒有抑真菌活性。余下部分減壓蒸干獲得烏鴉果根甲醇提取物固體192g，取100g用無菌水溶解并定容到100mL，提取物濃度為1000mg·mL－1，保存于4℃冰箱備用。

1.4 病原真菌孢子懸浮液和斷裂菌絲體的制備

用PDA培養基活化各病原真菌，培養72h后挑取菌落邊緣菌絲塊接種于PDB培養液中，裝液量為50mL／250mL三角瓶，于26℃、170r·min－1搖床振蕩培養72h。無菌紗布過濾除去大塊菌絲體，得到分生孢子懸浮液或斷裂菌絲體懸浮液，血球計數板計數，用滅菌的PDB液體培養基稀釋濃度至1×108cfu·mL－1。

1.5 抑菌活性的測定

采用改進牛津杯法即牛津杯雙層培養基法[8］測定烏鴉果根甲醇提取物對各病原真菌的抑菌活性。下層培養基為含1.2% 瓊脂的15mL PDA，上層培養基為含0.5% 瓊脂、1%病原真菌孢子懸浮液或斷裂菌絲體的5mL PDA。在每個雙層平板上放置2個內徑為6mm的無菌牛津杯。其中一個加入80μL無菌PDB培養液作為對照，另一個加入80μL烏鴉果根甲醇提取物。置于26℃恒溫培養箱中培養72h，測量抑菌圈直徑（不含牛津杯直徑），平行測定3次。

1.6 最小抑菌濃度的測定

采用兩倍瓊脂梯度稀釋法[9］測定烏鴉果根甲醇提取物對各病原真菌的最小抑菌濃度。烏鴉果根甲醇提取物經梯度稀釋后獲得濃度（mg·mL－1）分別為500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、1.9、0.98的系列工作溶液。依照1.5方法進行測定，以沒有明顯菌體生長的最低濃度作為最小抑菌濃度MIC（即產生明顯抑菌圈的最小濃度）。MIC的判讀和記錄方法參照文獻[10］。

1.7 最小殺菌濃度的測定

在MIC測定的基礎上，選取MIC、2倍MIC和4倍MIC的培養皿繼續培養72h，以完全無菌體生長的最低濃度為最小殺菌濃度MBC（即抑菌圈內72h后無菌體生長）[11］。

2 結果與討論

2.1 烏鴉果根甲醇提取物對病原真菌的抑制活性（表1 ）

由表1 可知，烏鴉果根甲醇提取物在1000mg·mL－1濃度下對供試菌株均表現出不同的抑制作用。這些植物病原真菌包括子囊菌亞門的長喙殼屬（Ceratocystis）、擔子菌亞門無性態的絲核菌屬（Rhizoctonia）、鞭毛菌來門的疫霉屬（Phytophthora）、半知菌亞門絲孢綱的葡萄孢屬（Botrytis）。表明烏鴉果根甲醇提取物具有廣譜抑制真菌作用，具有潛在的開發利用價值。

表1 烏鴉果根甲醇提取物對病原真菌的抑菌活性Tab.1 The antifungal activities of methanol extract from root of Vaccinium fragile Franch

2.2 烏鴉果根甲醇提取物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度（表2 ）

由表2 可知，烏鴉果根甲醇提取物對各病原真菌MIC在31.2～250.0mg·mL－1之間。

三七根腐病菌、煙草枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的MIC為31.2mg·mL－1，而前者的 MBC為31.2mg·mL－1，后兩者的 MBC為62.5mg·mL－1。水稻立枯絲核菌、魔芋枯萎病菌、玉米莖腐病菌、小麥紋枯病菌和煙草立枯絲核病菌的 MIC為62.5mg·mL－1，其中前2種菌株的MBC為125.0mg·mL－1，后3種菌株的MBC為62.5mg·mL－1。玉米小斑病、茶葉輪斑菌、康乃馨枯萎病菌、棉花紅腐病菌、小麥根腐病菌、小麥雪腐病菌、馬鈴薯晚疫病菌、甘蔗黑腐病菌、煙草赤星病菌和煙草疫霉病菌的MIC為125.0mg·mL－1，其中前4種菌株的 MBC為250.0mg·mL－1，后6種菌株的MBC為125.0mg·mL－1。玉米彎孢霉葉斑病菌、番茄灰霉病菌和蘋果斑點病菌的MIC和MBC均為250mg·mL－1。

表2 烏鴉果根甲醇提取物對各病原真菌的MIC和MBCTab.2 MIC and MBC of methanol extract from root of Vaccinium fragile Franch for different plant pathogens

2.3 討論

基于《中國有毒植物》和《中國土農藥志》及民間調查發現，野生植物烏鴉果具有作為植物源農藥開發的潛力。通過測試其甲醇粗提物對植物病原真菌的抑制活性測試，證明烏鴉果根甲醇提取物在室內條件下對各供試病原真菌確實有一定程度的抑制作用，且抑菌譜較廣，最小抑菌濃度及最小殺菌濃度均為31.2～250.0mg·mL－1。但是由于粗提物成分復雜，很可能是多種成分的協同作用，或是由于高濃度下造成高滲透壓導致真菌受損，因而本研究尚不能完全證明和解釋烏鴉果根甲醇提取物對植物病原真菌的活性作用和活性機制。為了科學解釋烏鴉果根甲醇提取物的抑真菌活性，為下一步綜合開發利用提供科學依據，后續將從以下幾方面開展研究工作：（1）選擇活性最強的菌株三七根腐病菌作為指示對象，利用活性跟蹤方法對烏鴉果根甲醇提取物進行系統分離純化。（2）對活性化合物進行結構鑒定，研究構效關系及其活性機制。（3）研究活性化合物對其它植物病蟲害的作用，擴大其使用范圍。

3 結論

烏鴉果根經甲醇回流提取、石油醚脫脂得到烏鴉果根甲醇提取物，采用雙層培養基法測定其抑真菌活性、瓊脂梯度稀釋法測定最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。結果表明，烏鴉果根甲醇提取物（1000mg·mL－1）對供試的21種真菌均有不同程度的抑菌活性，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為31.2～250.0mg·mL－1；且提取物抑菌能力與其濃度呈正相關關系。表明烏鴉果根甲醇提取物具有廣譜抑制真菌作用，可以作為植物源農藥進一步深入研究，具有潛在的開發利用價值。

[1]方瑞征.中國植物志[第57（3）卷］[M］.北京：科學出版社，1991：82－164.

[2]中國科學院昆明植物研究所.云南植物志（第五卷）[M］.北京：科學出版社，1991：288－348.

[3]《滇南本草》整理組.滇南本草[M］.昆明：云南人民出版社，1975：328－331.

[4]云南省彝族醫藥研究所.中國彝族藥學[M］.昆明：云南人民出版社，2004：216－217.

[5]張之道.彝藥本草（第一卷）[M］.昆明：云南人民出版社，2006：137.

[6]中國土農藥志編緝委員會.中國土農藥志[M］.北京：科學出版社，1959：115－116.

[7]李興玉，李立兵，李興奎.烏鴉果提取工藝研究[J］.國際中醫中藥雜志，2011，33（9）：814－816.

[8]Ahmed K Z，Mesterhazy A，Sagi F.In vitro techniques for selecting wheat （Triticum aestivum L.）for fusarium－resistance.I.Double－layer culture technique[J］.Euphytica，1991，57（3）：251－257.

[9]Zhang Dao－jing，Liu Rong－feng，LI Yuan－guang，et al.Two new antifungal cyclic lipopeptides fromBacillus marinus B－9987 [J］.Chem Pharm Bull，2010，58（12）：1630－1634.

[10]Joshi S，Subedi Y P，Paudel S K.Antibacterial and antifungal activity of heartwood of Acacia catechu of Nepal[J］.J Nepal Chem Soc，2011，27（1）：94－99.

[11]Hirsch P R.Plasmid determined bacteriocin production by Rhizobium leguminosarum[J］.J Gen Microbiol，1979，113（2）：219－228.