分枝桿菌轉化甾醇產9α－羥基雄甾烯酮促進劑的篩選

張懷成，王風清，馬昱澍，魏東芝

（華東理工大學 生物反應器國家重點實驗室 魯華生物技術研究所，上海200237）

自然界中存在著以膽固醇及其類似物和相關衍生物為代表的一大類化合物，即甾體化合物。這類化合物以環戊烷多氫菲為母核，攜帶不同修飾基團。由于其母核上不同位置的不同取代基，往往表現出顯著不同的生理活性[1］，對大腦的發育、穩態維持等生理機能的調控至關重要。甾體藥物主要是甾體激素類藥物以及甾體型抗生素，如膽酸、雌二醇、雄酮、煙曲霉酸、夫西地酸等[2］。

甾體藥物的合成，目前較成熟的商業應用工藝是利用薯蕷皂素（Diosgenin）經化學修飾成16－醋酸雙烯醇酮后進一步合成得到，但該工藝存在成本高、步驟多、收率低、經濟性差、環境友好度低、土地資源和自然資源浪費大等不足[3］。相較而言，甾體藥物的半合成制備，即利用天然甾體作為骨架進行結構改造更具優勢。其中以甾醇為原料、利用分枝桿菌等微生物轉化生產甾體醫藥中間體9α－羥基雄甾烯酮（9α－OHAD），是目前甾體醫藥工業體系的一條重要工藝路線。然而甾醇水溶性差、傳質效率低、底物毒害、產物抑制以及產物降解等問題均制約著微生物菌株轉化能力的提高，也是影響該工藝推廣應用的重要瓶頸[3］。

甾醇為非極性化合物，在水中的溶解度極低，僅約1μmol·L－1左右，且甾醇在水相中的傳質效率很低，其生物可利用度不高，嚴重制約了分枝桿菌對甾醇底物的攝取利用效率[4］。研究表明，環糊精、硅油、聚丙二醇（PPG）、聚乙二醇（PEG）、離子溶液（Ionic liquids）、鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）、有機試劑（如甲醇、乙醇、丙酮）等均能有效促進微生物對甾醇的轉化，可顯著提高目標產物的積累量[5，6］。目前，PEG、PPG、硅油作為甾醇轉化促進劑的相關研究備受關注[5，7，8］，但研究多局限于對有機溶劑、離子溶液、硅油等大類別的探究，而系統的、細致的應用性研究很少。基于此，作者在此就PEG200、PPG2000和多種硅油對分枝桿菌HK86轉化甾醇產9α－OHAD的促進效果進行了比較分析，以期篩選到優良的甾醇轉化促進劑。

1 實驗

1.1 菌株

新金分枝桿菌 HK86（Mycobacterium neoaurum HK86），自行保存。

1.2 培養基及各類配制溶液

種子培養基（MYC／01）：檸檬酸2g·L－1，甘油20g·L－1，K2HPO40.5g·L－1，檸檬酸鐵銨0.05g·L－1，MgSO4·7H2O 0.5g·L－1，NH4NO32g·L－1，加1L去離子水，用NaOH溶液調pH值至8.0。

種子固體培養基（MYC／01S）：以種子培養基（MYC／01）為基礎，添加1%瓊脂粉。

發酵培養基（MYC／02）：葡萄糖10g·L－1，檸檬酸2g·L－1，K2HPO40.5g·L－1，檸檬酸鐵銨0.05g·L－1，MgSO4·7H2O 0.5g·L－1，（NH4）2HPO43.5g·L－1，加1L去離子水，用NaOH溶液調pH值至7.0，添加設計濃度的甾醇。

甾醇母液（200g·L－1）：20g植物甾醇，添加5g吐溫－80，加熱溶解并定容至100mL，700W下超聲99次（每次超聲5s、間隔5s），4℃保存。

卡那霉素（Kanamycin）溶液：稱取1g卡那霉素溶解于10mL水中，將其配制成100mg·mL－1的母液，用0.22μm過濾器過濾除菌，而后按每管1mL分裝成小份，－20℃保存備用。工作液濃度為母液稀釋2000倍，即50μg·mL－1。

1.3 菌種保藏

菌株培養至OD600為2～3，甘油終濃度20%，于－40℃凍存。

1.4 方法

1.4.1 菌體的培養與甾醇轉化

在MYC／01S上涂布活化分枝桿菌HK86，挑取單菌落轉接至裝有MYC／01的5mL試管中進行種子一級活化，加入抗性（50μg·mL－1卡那霉素），培養5d左右至菌體呈亮黃色；而后以7%接種量將一級活化種子液轉接到裝有 MYC／01的搖瓶中（30mL／250 mL）進行二級活化，抗性添加同上，于30℃、200r·min－1培養活化3～4d至菌體呈淡黃色；再將二級活化種子液以10%的接種量轉接至裝有MYC／02的搖瓶中（30mL／250mL，底物濃度為10g·L－1），并以擬定添加方式和添加量加入甾醇轉化促進劑，于30℃、200r·min－1培養7d。最后萃取產物，進行定性和定量分析，評價各實驗組菌株對底物的轉化能力，并將其與對照組（加入等量的無菌水）相比較。

1.4.2 底物甾醇與產物9α－OHAD的分析

1.4.2.1 樣品制備

將發酵轉化液用乙酸乙酯以1∶1萃取2次，合并萃取液，減壓干燥后備用。

1.4.2.2 薄層層析（TLC）分析

實驗準備：層析液流動相為石油醚－乙酸乙酯（6∶4，體積比）；層析硅膠G／L板規格為5cm×10cm，于點樣端后0.5cm處鉛筆均勻標記以便進行結果的橫向分析，而后將其于100℃烘烤10min，備用；展層劑先加至層析缸中飽和30min左右；樣品用乙酸乙酯萃取或復溶。

樣品點板層析：用10μL移液槍分別吸取樣品10μL于各鉛筆標記處點樣，點樣間距約0.5～1cm；點樣方式：多次少量，盡量縮小點樣面積。

層析：將層析液倒入層析缸進行飽和，然后將點樣后的TLC薄板斜置于層析缸內，待展層劑擴散至薄板上端后，取出薄板，用吹風機吹干，置于254nm紫外下觀察斑點，并初步判斷轉化水平。

顯色：將上一步驟處理后的TLC薄板用20%稀硫酸均勻噴淋，用干紙巾擦拭薄板背面殘液，之后將其置于110℃烘箱內烘烤15min左右，使底物和各組分產物、副產物充分顯色，并進行定性分析。

1.4.2.3 高效液相色譜（HPLC）分析

樣品處理：轉化發酵液用乙酸乙酯以1∶1萃取，12 000r·min－1離心3min；取100μL含有產物的上清液置于潔凈的1.5mL EP管中，置于通風櫥中至乙酸乙酯揮發殆盡；而后加入10倍（1000μL）色譜級甲醇復溶（即將樣品稀釋10倍進行檢測）。

檢測參數：Agilent 1100型高效液相色譜儀；DAD紫外檢測器，波長254nm；柱溫40℃；進樣量5μL；流速1mL·min－1；流動相為甲醇∶水（7∶3，體積比）；Agilent XDB－C18色譜柱（4.6mm×250mm）。

2 結果與討論

2.1 甾醇轉化促進效果比較

選擇PEG200、PPG2000和二甲基硅油作為甾醇轉化促進劑，在發酵培養48h時添加，添加濃度均為5%，考察不同轉化促進劑對甾醇轉化的促進作用，結果見圖1。

圖1 PEG200、PPG2000和二甲基硅油對甾醇轉化的促進作用Fig.1 Promotion effect of PEG200，PPG2000and dimethyl silicone oil on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖1可知，PEG200、PPG2000和二甲基硅油的加入均能在一定程度上促進菌株對底物甾醇的轉化能力，產物9α－OHAD的積累量分別提高了50%、85%和95%，其中二甲基硅油的促進效果最顯著。因此，后續研究進一步考察多種硅油對甾醇轉化的促進效果。

2.2 甾醇轉化促進劑的篩選

基于硅油對微生物轉化甾醇具有顯著促進作用，對7種不同規格的硅油進行了更為系統、細致的分析，不同硅油對甾醇轉化的影響見圖2。

圖2 不同硅油對甾醇轉化的影響Fig.2 Effect of different silicone oils on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖2可知，苯甲基硅油、苯基硅油、二甲基硅油和聚醚改性硅油對甾醇的轉化均有不同程度的促進作用，尤其是聚醚改性硅油，產物積累量提高了近300%；而烷基硅油、氨基硅油和2420硅油則相反，對甾醇轉化有比較明顯的抑制作用，其中2420硅油對甾醇轉化的抑制最為嚴重。這表明并非所有硅油都會對甾醇的轉化起促進作用，這一點在相關文獻[5，7，8］中未指明。

隨后考察了硅油添加量對甾醇轉化的影響，結果見圖3。

圖3 硅油添加量對甾醇轉化的影響Fig.3 Effect of addition amount of silicon oil on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖3可知：總體上，具有正面促進作用的硅油，其添加30%的效果略好于添加1%和5%時的效果，但對于聚醚改性硅油來講，添加5%的效果卻要優于添加30%的效果，轉化率高出20%左右。經過對各規格硅油的1%、5%和30%三個不同添加量的轉化分析比較，更加確認了聚醚改性硅油在微生物甾醇轉化上的突出表現，排除了由于促進劑非最優濃度導致促進效果有限而造成的對最佳促進劑選擇的干擾。同時，由圖3還可知聚醚改性硅油擁有較低的最佳添加濃度，更有生產應用價值。綜上所述，選擇聚醚改性硅油為最佳甾醇轉化促進劑。

2.3 聚醚改性硅油添加量和添加方式的優化

進一步考察聚醚改性硅油添加量對甾醇轉化的影響，結果見圖4。

圖4 聚醚改性硅油添加量對甾醇轉化的影響Fig.4 Effect of addition amount of polyether－modified silicone oil on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖4可知，聚醚改性硅油在底物甾醇投料量為10g·L－1的條件下，最佳添加量為15%。

進一步對聚醚改性硅油的添加方式進行考察發現：聚醚改性硅油在第0d添加（即與菌種轉接同時直接添加）、第1d添加和第2d添加的實驗結果差別不大，沒有顯著的優劣之分。同時，聚醚改性硅油在115℃下保持30min后，其對甾醇轉化的促進作用也未出現顯著差別，這表明聚醚改性硅油具有一定的耐高溫特性。鑒于此，為了操作方便，同時避免添加聚醚改性硅油時可能產生的不必要染菌，選擇在配制發酵培養基時同時加入聚醚改性硅油和甾醇，滅菌后使用。

3 結論

PEG200、PPG2000和二甲基硅油的加入均能在一定程度上促進分枝桿菌HK86對底物甾醇的轉化能力，提高產物9α－OHAD的積累量。最終篩選到的最佳甾醇轉化促進劑是聚醚改性硅油，其最佳添加方式是在發酵起始時與甾醇同時添加，10g·L－1的甾醇投料量下的最佳添加量為15%。

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