成團泛菌依賴型磷酸甘油酸變位酶基因的克隆、序列分析及產氫中的差異表達

馬穎超, 朱大玲, 王廣策

(1. 天津科技大學 海洋科學與工程學院, 天津市海洋資源與化學重點實驗室, 天津 300457; 2. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071)

磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase,PGM; EC5.4.2.1)是糖酵解過程中的一個關鍵酶, 主要催化 3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate, 3-PGA)與2-磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate, 2-PGA)之間的可逆反應[1-2]。PGM有兩種類型: 一種為依賴型磷酸甘油酸變位酶(cofactor-dependent phosphoglycerate mutase, dPGM), 行使功能時需要輔因子(cofactor)2,3-二磷酸甘油酸(2, 3-bisphosphoglycerate, 2,3-BPGA), 存在于所有脊椎動物、大部分無脊椎動物、部分真菌以及某些細菌中, 特別是革蘭氏陰性菌中; 另外一種為非依賴型磷酸甘油酸變位酶(cofactor-independent phosphoglycerate mutase, iPGM),催化反應時不需要 2, 3-BPGA 作為輔因子, 存在于所有植物、一些無脊椎動物、部分真菌和細菌中, 特別是革蘭氏陽性菌中[3-8]。碳水化合物, 尤其是葡萄糖是異養微生物的主要能源, 用于維持正常的生命活動及生命特征, 而糖酵解又是利用葡萄糖的必經之路, 也是微生物利用葡萄糖的第一步, 所以糖酵解在異養微生物中具有重要作用[9]。氫氣是微生物的次級代謝產物, 它的產生離不開糖酵解, 而糖酵解中的關鍵酶之一PGM也必定與產氫有著密切關系。然而, 目前僅對這兩種PGM的基因及蛋白結構方面有很多報道, 有關PGM在氫氣產生方面的研究卻幾乎沒有, 因此, 研究 PGM 與產氫的關系, 進而通過調控糖酵解作用來提高氫氣產量是一個新的研究方向, 具有重要意義。

成團泛菌(Pantoea agglomerans)BH-18是從紅樹林污泥中分離純化獲得的一株革蘭氏陰性、兼性厭氧、高效產氫菌株[10]。該菌具有生長條件簡單、耐氧、耐鹽等優點, 是優良的高效產氫候選工程菌株。故本實驗以成團泛菌BH-18為對象, 克隆了編碼dPGM的基因序列, 并對其序列進行分析, 同時采用RT-PCR的方法監測了成團泛菌BH-18在產氫過程中dPGM基因轉錄水平上的變化, 為進一步研究成團泛菌產氫機理, 進而改造獲得高效產氫菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養條件

成團泛菌BH-18是從廣西省北海(109°E, 21°N)紅樹林污泥中分離得到的高效產氫菌株。所用的培養基為LMH培養基(pH7.2～7.5), 培養條件為37℃振蕩培養[10]。用于提取細菌總DNA的成團泛菌接種于含有100 mL LMH培養基的錐形瓶中; 用于提取產氫過程中細菌總RNA的成團泛菌接種于含有200 mL LMH培養基的血清瓶中, 充入惰性氣體后進行間歇產氫實驗。

1.2 編碼dPGM基因的克隆

1.2.1 成團泛菌BH-18總DNA的提取

取對數期的成團泛菌BH-18, 采用常規酚-氯仿法提取獲得細菌總DNA[11], 之后進行1.0 %瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的完整性。

1.2.2 引物設計

根據GenBank上已登錄的腸桿菌編碼dPGM的基因序列設計引物gpmA-1F(5′-ATGGCTGTAACTA AGCTGG-3′)和gpmA-751R(5′-TTACTTCGCTTTACC CTGA)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 編碼dPGM基因的克隆

以成團泛菌BH-18總DNA為模板,gpmA-1F和gpmA-751R 為引物, PCR擴增反應采用25 μL體系:10×Taq Buffer, 2.5 μL; dNTP Mixture(各2 mmol/L), 2 μL;引物(10 μmol/L)各0.5 μL; 模板DNA, 1μL; Taq酶(5 U/μL)(Solarbio), 0.2 μL; 加滅菌蒸餾水至25 μL。反應程序為: 94 ℃ 預變性 5 min; 94 ℃ 3 0 s, 49 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min, 35個循環; 72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測, 用Bio-Rad Chemi-DocXRS凝膠成像系統采集圖像。

1.3 編碼dPGM的基因序列分析

PCR產物經凝膠回收試劑盒(Omega)回收后, 由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。通過軟件BLAST, 將該序列與相似的變位酶基因序列進行比對。同時, 根據推導出的氨基酸序列, 采用Bioedit和Mega4軟件構建NJ系統進化樹

1.4 dPGM 在產氫過程中轉錄水平上的差異表達分析

1.4.1 成團泛菌BH-18總RNA的提取

分別在成團泛菌BH-18 產氫開始(A)、產氫2 h(B)、產氫4 h(C)、產氫6 h(D)、產氫8 h(E)和產氫結束(F)6個時間點取發酵液, 離心收集菌體, -80 ℃ 凍存用于RNA的提取。成團泛菌BH-18總RNA通過RNAprep pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取獲得。通過1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整性, 通過測定A260/A280判斷RNA的濃度和純度。

1.4.2 引物設計

根據已測定的成團泛菌BH-18中編碼dPGM的基因序列, 設計引物gpmA-292F(5′- CTCAACAA AGCCGAAACCGC-3′)和gpmA-565R(5′- CAGGGAG TTACCGTGAGC G-3′)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4.3 dPGM在產氫過程中轉錄水平上的差異表達分析

以提取的成團泛菌BH-18總RNA為模板, 根據說明, 用Promega的M-MLV反轉錄酶合成cDNA第一鏈, 以此為模板, 用引物gpmA-292F和gpmA-565R,進行RT-PCR擴增dPGM基因的cDNA片段。RT-PCR擴增反應采用25 μL體系: 10×Taq Buffer, 2.5 μL;dNTP Mixture(各2 mmol/L), 2 μL; 引物(10 μmol/L)各0.5 μL; 模板cDNA, 0.5 μL; Taq (5 U/μL)(Solarbio),0.2 μL; 加滅菌蒸餾水至25 μL。然后按以下步驟進行PCR 循環: 94 ℃ 預變性 5 min; 94 ℃ 3 0 s, 53 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min, 35個循環; 72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物取5 μL 經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用Bio-Rad ChemiDocXRS凝膠成像系統采集圖像。

2 結果

2.1 編碼dPGM基因的克隆

圖1 成團泛菌BH-18中編碼dPGM基因的克隆Fig.1 Clone of dPGM-encoding gene in Pantoea agglomerans

PCR擴增獲得兩條帶(圖1), 片段大小分別約為750bp和500bp。其中750bp與文獻中報道的編碼dPGM的基因大小一致[12-13], 所以初步確定該條帶為目的片段。但是由于該條帶較弱, 故回收純化后進行二次擴增, 以獲得高純目的基因。

2.2 編碼dPGM基因的測序結果

將大小約為750 bp的條帶大量擴增, 純化該條帶后送該條帶到華大基因進行序列測定。測序結果表明該基因整個開放閱讀框ORF為753bp, 編碼250aa, 序列(GenBank登錄號: JX156332)見圖2。

2.3 編碼dPGM的基因序列分析

測序結果用軟件BLAST將該序列與相似的變位酶基因序列進行比對。結果表明該基因保守性相對較高, 與腸桿菌科的眾多菌株中的dPGM基因相似性100%, 這也與之前的報道相符[13]。采用Bioedit和Mega4軟件成功構建NJ系統進化樹, 結果表明成團泛菌BH-18的dPGM氨基酸序列與Enterobacter asburiae的dPGM聚為一類, 而與成團泛菌屬菌株的相應蛋白關系較遠(圖3)。由此表明, dPGM的氨基酸序列在屬內不保守。

2.4 成團泛菌BH-18總RNA的提取結果

圖2 成團泛菌BH-18中編碼dPGM基因完整開放閱讀框及推導的氨基酸序列Fig.2 The complete open reading frame of dPGM-encoding gene and the deduced amino acid sequence of dPGM in Pantoea agglomerans BH-18

圖3 成團泛菌BH-18 dPGM NJ法構建的系統進化樹(基于氨基酸序列)Fig.3 The NJ phylogenetic tree of dPGM in Pantoea agglomerans BH-18, based on the amino acid sequences

如圖4所示, 成團泛菌BH-18產氫不同階段提取的總RNA, 經瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結果總RNA條帶清晰, 表明提取的總 RNA完整性較好, 沒有發生降解。經紫外分光光度計分析,A260/A280的比值為2.0,表明總RNA無蛋白質和DNA污染。因此提取的總RNA完整性和質量都較好, 可用于反轉錄及半定量分析。

圖4 產氫不同階段提取到的成團泛菌BH-18 RNAFig.4 RNA extraction of Pantoea agglomerans BH-18 in different phases of hydrogen production

2.5 dPGM 在產氫過程中轉錄水平上的差異表達分析

RT-PCR擴增結果見圖5, 圖5a是管家基因16s DNA在產氫不同階段的RT-PCR結果。由圖5a可知,管家基因在各個階段表達穩定, 可以作為樣本的參照。圖5b是編碼dPGM基因在產氫不同階段的RT-PCR結果。由圖5b可知, 在產氫開始時編碼dPGM的基因未轉錄; 在產氫2 h和4 h時基因開始轉錄但轉錄量較低; 產氫6 h和8 h時轉錄量升高,其中產氫6 h時轉錄量達到最高; 產氫結束后, 該酶還有少量的轉錄。即酶的轉錄是伴隨著產氫而進行的。

圖5 RT-PCR擴增結果Fig.5 RT-PCR amplification results

3 討論

本實驗從成團泛菌BH-18中克隆獲得了編碼dPGM的基因, 其ORF為753 bp, 編碼250 aa。通過BLAST軟件, 將編碼dPGM的基因與相似的變位酶基因序列進行比對。結果表明該基因保守性較高, 與腸桿菌科眾多菌株中的dPGM基因相似性100%。之后又根據翻譯獲得的氨基酸序列, 采用Bioedit和Mega4軟件成功構建NJ系統進化樹, 結果表明dPGM的氨基酸序列在屬內不保守, 但是與Enterobacter asburiaedPGM的氨基酸序列相似。最后, 采用RT-PCR的方法監測成團泛菌BH-18產氫過程中編碼dPGM的基因在轉錄水平上的變化, 發現酶的轉錄是伴隨著產氫而進行的, 之前的研究[10]顯示產氫6 h和8 h是產氫速率較高的階段, 而在此階段該酶的轉錄量也增加, 這說明該基因的轉錄與產氫情況呈正相關。由此我們推斷, 依賴型磷酸甘油酸變位酶可能是成團泛菌BH-18產氫過程中的關鍵酶之一。

成團泛菌BH-18是一種抗逆性較強的高效產氫菌株。它具有生長條件簡單、耐氧、耐鹽等優點, 適合作為優良的產氫工程菌株。成團泛菌BH-18并不是在生長初期就產生氫氣, 接種的菌株直到對數生長期的后期才開始產生氫氣, 產氫時間長達12h, 而且氫氣并不是其生長代謝所必須的物質, 由此可見,氫氣是成團泛菌BH-18的次級代謝產物。同時, 整個產氫過程一直處于厭氧的環境下, 而一般微生物在厭氧環境中, 需要進行糖酵解作用來提供生命活動所需要的能量, 因此, 糖酵解作用與成團泛菌發酵產氫密切相關, 而通過調控糖酵解作用來提高氫氣產量將是一個新的研究方向。磷酸甘油酸變位酶是糖酵解作用中的一個重要酶, 現代醫學中把敲除編碼磷酸甘油酸變位酶的基因或阻斷其表達作為控制腫瘤生長的新思路[14], 而在微生物制氫方面, 目前沒有相關的報道, 但本文研究發現dPGM的表達在轉錄水平上與產氫情況呈正相關, 這一發現表明該酶可能是產氫的關鍵酶之一, 或許可以通過dPGM來調控糖酵解作用, 進而影響氫氣的產生。即便這一設想不能實現, 也可以為深入研究糖酵解作用與產氫過程的相關性及基因工程改造獲得高效產氫菌株提供理論依據。

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