柴油分散液對馬糞海膽細胞色素P450活性的影響

馬忠強, 高亞麗, 剛 錳, 楊柏林, 熊德琪

(大連海事大學 環境科學與工程學院, 遼寧 大連116026)

馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)是海洋底棲環境中比較常見的無脊椎動物, 在系統分類學上屬于棘皮動物門、游在亞門、海膽綱、正形目、球海膽科。細胞中的細胞色素P450主要分布在內質網和線粒體內膜上, 作為一種末端加氧酶, 參與生物體內的甾醇類激素合成等過程。近年來, 對細胞色素P450的結構、功能, 特別是對其在藥物代謝中的作用的研究有了較大的進展。最新研究表明, 細胞色素P450還是藥物代謝過程中的關鍵酶, 對細胞因子和體溫調節都有重要影響, 最早的研究是在魚類肝臟中P450展開的。目前, 魚肝細胞色素P4501A作為有機物污染的監測指標已經大量地應用于野外現場研究和實驗室研究[1-3]。太平洋牡蠣經過石油烴污染暴露后, 通過RT-PCR研究表明, P4501A1基因、谷胱甘肽硫轉移酶基因的mRNA表達水平增加[4]。本文以馬糞海膽為受試生物, 研究在三個不同柴油分散液濃度下, 海膽三個部位P450活性的變化規律, 研究結果可為石油烴對海洋生物的影響和污染監測提供有效的技術方法。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及儀器

馬糞海膽采于大連太平洋水產養殖場。選取發育良好、個體大的海膽進行試驗(海膽的平均體重為81.3 g, 平均殼長為6.4 cm,平均殼高為3.2 cm)。海水取自大連灣, 經沉淀過濾后用于試驗, 溫度為(22±2)℃, 鹽度為31.35, 電導率為47.3 S/m, pH為8.13。

四氯化碳為分光純; 無水Na2SO4、濃H2SO4、鹽酸、NaCl均為分析純; 相關試劑盒購自美國ADL公司; 0號柴油購于大連凌水加油站。

JDS-109U紅外測油儀、JB－3型磁力攪拌器、Thermo高速冷凍離心機、HH-S水浴鍋、酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 受試液的制備

柴油分散液(WAFs)的制備: 將 0號柴油和海水以1∶9的比例進行混合。用磁力攪拌器連續攪拌24 h, 分液漏斗中靜置4 h, 下層的水相為母液, 于4 ℃保存, 使用時候以紅外測油儀進行濃度測定, 并稀釋成試驗需要的濃度。

1.2.2 亞急性毒性試驗

設定 3個濃度組, 每個濃度組投入充足的稀釋液, 每組投放15只海膽。試驗期間12 h換稀釋液1次, 并進行打氧和投餌。

3個濃度組分別為5、20、50 mg/L(以下分別用低濃度、中濃度、高濃度來表示), 測定時間分別設為第2、4、8、12天?；謴驮囼灲Y束時間為25 d,測定的部位為腸體、體液和性腺。

在每組濃度、每個測定時間下, 分別取出3只海膽對其三個部位進行P450酶含量的測定, 在12 d后,每個濃度組還剩下3只海膽, 然后, 把這3只海膽放進干凈的海水中進行恢復試驗, 直到25 d后再測定三個部位酶的活性。另外, 同時在干凈的海水中飼養15只健康的海膽, 用于空白對照試驗。(注: 對海膽進行酶測定的時候都要得到3只海膽酶活性的數值,然后進行平均求值, 此數值為在此濃度和此測定時間P450活性的最終結果。)

1.2.3 酶活性的測定方法

(1)稱取一定質量的性腺或者腸體(約0.2～1 g),用冰冷的生理鹽水漂洗, 濾紙拭干, 稱重, 放入5～10 mL的小燒杯中。

(2)用量筒取冰冷的生理鹽水(0.86%的生理鹽水的質量應該是組織質量的9倍), 用移液管將總量2/3的生理鹽水移入燒杯中, 用剪子盡快剪碎組織塊(氣溫高時要放在冰上進行)。

(3)將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中, 再把剩余的1/3的生理鹽水沖洗殘余在燒杯中的碎組織一起倒入勻漿管中勻漿, 充分勻漿后, 把此勻漿液用離心機3000 r/min離心15 min, 之后留上清液用于試驗的測定。

(4)體液酶活性測定, 取海膽體液20 μL, 用蒸餾水稀釋至1 mL, 配成1∶49的溶液, 然后充分放置5 min直到使玻璃管中的溶液對光呈完全透明狀, 才能進行酶的檢測。

2 結果與分析

2.1 馬糞海膽不同部位的P450含量

馬糞海膽不同組織中的P450含量測定結果見表1?？梢钥闯? 在正常條件下, 腸體、性腺和體液中的P450含量有明顯差異。

表1 馬糞海膽不同部位的P450含量測定結果Tab.1 The P450 content in different tissues of Hemicentrotus pulcherrimus

2.2 柴油分散液對馬糞海膽P450活性的影響

圖1 不同柴油分散液質量濃度下馬糞海膽腸體中P450含量隨時間的變化Fig.1 The time-effect response of P450 activity in intestine of Hemicentrotus pulcherrimus with different concentrations of diesel

2.2.1 柴油分散液對馬糞海膽腸體的 P450活性的影響

圖1為柴油分散液對海膽腸體P450活性影響試驗結果。從圖中可以看到: 2 d時, 低、中濃度組和對照組相比幾乎無顯著差異, 但是高濃度組P450的活性則被誘導, 與前兩個濃度梯度存在較為明顯的差異; 4 d時, 中濃度組P450的含量開始誘導, 而高濃度組的活性開始回落; 在第 8 天時, 低濃度組 P450的含量被誘導, 后兩個濃度組還是在回落; 第12 天時, 這三個濃度組的P450含量較之前都有所回落。所以, 柴油分散液對馬糞海膽腸部P450的含量影響最為明顯。從圖中還可以看到, 三個濃度組下馬糞海膽腸部的 P450含量隨時間的變化情況, P450含量首先增加然后降低, 即活性先被誘導后被抑制。第2天時, 高濃度組的含量是對照組的 143%; 但是當恢復試驗結束的時候, 三組濃度下的腸體P450含量基本與對照組一致。

2.2.2 柴油分散液對馬糞海膽體液P450活性的影響

從圖2中可以看到: 2 d時, 低濃度組和對照組之間沒有明顯的差異, 中濃度組P450的含量比較低,高濃度組P450明顯增加, 和中濃度組之間有顯著差異; 4 d時低濃度組P450含量增高, 高濃度組P450

含量達到高峰; 第8 天時, 前兩個濃度組P450含量達到高峰, 而高濃度 P450含量開始回落; 第 12 天時, 前兩個濃度組較第 8 天時有所回落, 但是高濃度組反而升高。所以, 柴油分散液對馬糞海膽體液P450含量的影響也比較顯著。三組濃度下, 隨著時間的推移, 體液中的 P450含量先增加后下降, 效應顯著。當恢復試驗結束的時候, 三個濃度組之間體液中的P450活性差異基本消除, 與對照組一致。

2.2.3 柴油分散液對馬糞海膽性腺P450活性的影響

圖2 不同柴油分散液質量濃度下馬糞海膽體液P450含量隨時間的變化Fig.2 The time-effect response of P450 activity in coelomic fluid of Hemicentrotus pulcherrimus with different concentrations of diesel

圖3 不同柴油分散液質量濃度下馬糞海膽性腺P450含量隨時間的變化Fig.3 The time-effect response of P450 activity in gonad of Hemicentrotus pulcherrimus with different concentrations of diesel

從圖3中可以看到: 對照組P450的含量比較穩定。2 d時, 三個濃度組P450的含量都有明顯的增加,與濃度成正比關系; 4 d時低濃度組P450含量增高,中、高濃度組P450含量明顯下降; 第8 天時低濃度組的 P450也開始有所回落; 第 12 天時, 這三個濃度組較第 8 天也是略有回落。所以, 柴油分散液對馬糞海膽性腺P450含量的影響也比較顯著。隨著時間的推移, 性腺中的 P450含量先增加后下降, 明顯產生了先誘導后抑制的效應。當恢復試驗結束的時候, 三個濃度組之間性腺中的P450活性差異基本消除, 與對照組趨于一致。

2.2.4 柴油分散液暴露下海膽 P450活性的變化規律比較

從表2可以看出, 油污染會明顯影響海膽體內各部位的P450活性, 總體上呈現先誘導、后抑制的規律。隨著油濃度的增加, 最大誘導率也在增加, 并且高濃度組時P450出現誘導的時間比低濃度組要早。隨著暴露時間的增加, P450活性逐漸被抑制, 且濃度越高, 抑制作用出現的時間越早。

表2 不同油濃度下海膽三個部位P450活性的變化情況比較Tab.2 Effects of different concentrations of WAFs on P450 activities

3 討論

從實驗結果可以看出: 在柴油分散液的低濃度和中濃度組條件下, 海膽的腸體、體液和性腺等不同部位的P450酶一般在暴露4～8 d后會出現誘導效應, 在8～12 d后開始產生抑制作用。而在高濃度時, 各部位的P450含量在暴露2～4 d時就會迅速提高, 達到峰值, 之后開始逐漸受到抑制, 甚至低于正常水平。說明油污染會顯著影響海膽的抗氧化還原系統, 在油污染程度較低時和污染初期, 由于海膽抗氧化還原系統對污染的應激反應, 細胞色素P450活性首先被誘導, 并且污染程度越大, 海膽抗氧化還原系統的應激反應出現得越早, 作用越強; 但隨著污染程度和時間的增加, 由于中毒反應導致酶活性受到抑制而逐漸下降。在停止污染暴露12 d左右時間后, 各部位P450含量會逐漸恢復到原來水平, 說明海膽抗氧化還原系統具有一定的自我修復能力。

相關研究也發現在受到有毒物質作用時, 生物體內酶活性總體上會呈現先升后降的趨勢[5-9]。利用該現象, 國外學者以 P450作為毒理學指標, 在多環芳烴(PAHs)、PCBs、TCDDs的生物監測方面做了較多的研究工作。如法國選擇了兩種海魚的 EROD活性作為監測PAHs和PCBs的指標, 對周邊海域環境進行監測[10]。挪威也把鯰魚CYPIA的誘導作為監測周邊海域石油烴、PAHs、PCBs、PCDDs、其他鹵代化合物、農藥等污染的指標[11]。相對來說, 國內在此方面的研究較少, 只有朱必鳳[12]提出可用鯽魚肝微粒體芳烴羥化(AHH)酶指示水體中多環芳烴污染等少量成果報道。因此本文以海膽為對象研究其體內P450酶受石油烴污染的影響規律具有重要的意義,海膽P450活性可作為海洋中石油烴污染程度監測的毒理學指標。

[1]Codi S, Humphrey C, Klumpp D, et al. Barramundi as an indicator species for environmental monitoring in North Queensland, Australia: laboratory versus field studies[J]. Environ Toxicol Chem,2004, 23(11):2737-2744.

[2]Den Besten P J, Valk S, Van Weerlee E, et al.Bioaccumulation and biomarkers in the sea star Asterias rubens (Echinodermata: Asteroidea): a North Sea field study[J]. Mar Environ Res,2001, 51(4): 365-387.

[3]Kopecka-Pilarczyk J, Correia A D. Biochemical response in gilthead seabream (Sparus aurata)to in vivo exposure to a mix of selected PAHs[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2009, 72(4): 1296-1302.

[4]Hansen B H, Altin D, Hessen K M,et al. Expression of ecdysteroids and cytochrome P450 enzymes during lipid turnover and reproduction in Calanus finmarchicus(Crustacea: Copepoda)[J]. Gen Comp Endocrinol,2008,158(1): 115-121.

[5]Pascual P, Pedrajas J R, Toribio F, et al. Effect of Food Deprivation on Oxidative Stress Biomarkers in Fish(Sparus aurata)[J]. Chemico-Biological Interactions,2003, 145: 191-199.

[6]Oruc E O, Sevgiler Y, Uner N, et al. Tissue-Specific Oxidative Stress Responses in Fish Exposed to 2,4-D and Azinphosmethyl[J]. Biological Sciences, 2004, 137:43-51.

[7]Box A, Sureda A, Deudero S, et al. Antioxidant response of the bivalve Pinna nobilis colonised by invasive red macroalgae Lophocladia lallemandii[J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2009, 149:456-60.

[8]Cheung C C, Siu W H, Richardson B J, et al. Antioxidant responses to benzo[a]pyrene and Aroclor 1254 exposure in the green-Lipped mussel, Perna viridis[J]. Environ Pollut,2004, 128: 393-403.

[9]Martín-Díaz M L, Blasco J, Sales D, et al. Field validation of a battery of biomarkers to assess sediment quality in Spanish ports[J]. Environ Pollut, 2008, 151: 631-640.

[10]Galgani F. Monitoring of pollutant biochemical effects on marine organisms of the French coasts[J].Oceanologica ACTA, 1992, 15: 52-61.

[11]Anders Gokso yr. Characterization of the cytochrome P450 mono-oxygenase system in fish liver, metabolism and effects of organic xenobiotics[D]. Trodheim: Norweigian University of Science and Technology, 1987.

[12]朱必鳳, 馬海燕. 鯽魚肝微粒體芳烴羥化酶指示多環芳烴對水體污染的研究[J]. 中國環境科學, 1995,15:153-156.