基于線粒體基因序列和齒舌對古氏非螺分類地位的探討

李海濤, 時小軍, 周俊杰, 周 鵬, 呂向立

(國家海洋局 南海環境監測中心, 廣東 廣州 510300)

幾個世紀以來, 貝殼形態一直是腹足類動物最主要的分類依據[1]。傳統的分類學者主要是基于貝殼最主要的幾個特征來對物種進行分類。但這些特征在進行科、屬等較高階元劃分時易受到分類者主觀認識的影響[2]。

分子生物學技術的迅速發展, 為解決經典分類中的疑難問題提供了有力的幫助。線粒體DNA因其分子結構簡單、嚴格母系遺傳、幾乎不發生重組、進化速率快等優點, 廣泛應用于海洋腹足類分子系統發育研究中[3-6]。

古氏非螺(Afer cumingii(Reeve, 1844))是一種在我國較為少見的海洋腹足類, 以前僅在臺灣地區有過報道, 大陸一直未采到標本。因未做過系統研究,該種在中國大陸和日本被歸為犬齒螺科(Vasidae)[7-10], 中國臺灣[11]將本種歸入拳螺科(Turbinellidae)。而根據齒舌的構造, Fraussen 等[12]將非螺屬(Afer)修訂到蛾螺科(Buccinidae)內, 但這一結論至今仍未被廣泛采用。以往的形態分類, 可能是因非螺屬貝殼軸唇上具有褶襞這一特征, 而被歸為犬齒螺科或拳螺科[12]。到目前為止, 非螺屬的分類地位還缺乏分子證據的支持。本研究基于線粒體 CO1和16S rRNA基因序列, 并依據齒舌形態, 探討了古氏非螺的分類地位, 為進一步證實非螺屬的分類地位提供分子證據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的古氏非螺標本共 5個, 其中兩個為活體, 標本采自南海北部陸架區, 水深140～176 m。活體標本于－20℃冷凍保存帶回實驗室后解剖其齒舌,肌肉組織保存于90%乙醇溶液中備用。

1.2 DNA提取、PCR擴增

取樣品腹足肌100 mg左右, 采用CTAB法提取基因組DNA, 酚/氯仿純化, -20℃保存備用。

擴增 CO1基因的引物為: LCO-1490 5’- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’和 LCO-2198 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’[13];擴增 16S rRNA基因的引物為 16sar-L 5’-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’和 16sbr-H 5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’[14]。

PCR 反應體系為 50 μL, 包括 10×buffer(含Mg2+)5 μL, dNTP 200 μmol/L, 引物各 0.2 μmol/L,Taq酶1.25 U, DNA模板1 μL, 滅菌蒸餾水補足至50 μL。PCR反應條件為: 94℃預變性3 min, 然后進行35個循環, 每循環包括94℃1 min, 50℃1 min, 72℃1 min, 最后72℃延伸10 min。PCR產物經電泳檢測后,送上海生工生物工程有限公司進行純化并雙向測序。

1.3 序列分析

利用DAMBE軟件對GenBank中部分已知蛾螺科種類的序列與本研究中測定的序列進行多序列比對。以犬齒螺科種類為外群, 采用MEGA 4.1軟件以鄰接法(neighbor joining, NJ)和最大簡約法(maximum parsimony, MP)構建分子系統發育樹, 系統樹各分支的置信度由Bootstrap l000循環檢驗。大于50%的Bootstrap支持率標注在系統樹上。

2 結果

2.1 貝殼及齒舌特征

貝殼呈長紡錘形, 螺層約7層; 殼高65～76 mm,殼寬27～30 mm; 殼表黃褐色, 具有深褐色斑點和斑塊, 并雕刻有明顯的細螺肋; 體螺層膨大; 每一螺層的中部擴張形成肩角, 肩角上有一列發達的結節狀突起, 體螺層的肩角上具有10～12個; 殼口大, 卵圓形, 內淡褐色或白色; 前水管溝長, 半管狀, 末端常彎曲; 軸唇上有一明顯的褶襞; 厴角質, 黃色, 周緣光滑(圖 1)。

圖1 古氏非螺的貝殼Fig. 1 Shells of Afer cumingii

齒舌為典型的蛾螺科類型, 齒式 0·1·1·1·0, 無緣齒。側齒筆架狀, 具3枚發達的齒尖, 曲向內側, 外側一枚最為發達, 形似鐮刀; 中央齒基板元寶形, 在中部彎曲并加厚, 其上具3枚齒尖, 呈“山”字形, 中間一枚齒尖最發達(圖2)。

2.2 序列特征

測序結果提交 GenBank獲得登錄號: 兩條 16S rRNA基因序列為 JX469112和 JX469113; 兩條CO1基因序列為JX469114和JX469115。兩個古氏非螺個體CO1和16S rRNA 基因片段的長度分別為658 bp 和509 bp(不包括引物區), 無堿基的插入/缺失。CO1基因片段A, T, G, C的比例分別為26.3%,37.2%, 19.1%和17.3%; 第三位密碼子A, T, G, C的比例分別為41.8%, 42.7%, 8.6%和6.8%, A+T的比例顯著高于G+C的比例。兩條CO1基因序列存在2個(0.3%)堿基的差異, 均為密碼子第三位堿基, 未造成氨基酸序列的改變。16S rRNA基因片段A, T, G, C的比例分別為34.4%, 30.5%, 19.6%和15.5%; 兩條序列亦存在2個(0.4%)堿基的差異。CO1和16S rRNA基因片段的A+T的比例均明顯高于G+C的比例。

圖2 古氏非螺的齒舌Fig. 2 Radular teeth of Afer cumingii

2.3 系統學分析結果

本文基于CO1和16S rRNA 基因序列分別構建了 NJ和 MP樹, 但在文中僅給出 NJ樹, NJ樹的Bootstrap支持率標注在節點斜線左側, MP樹的Bootstrap支持率標注在節點斜線右側。基于CO1基因構建的 NJ和 MP樹的拓撲結構完全一致, 基于16S rRNA基因構建的兩種樹的拓撲結構存在一定的差異?；趦蓚€基因構建的系統發育樹都顯示, 古氏非螺都與蛾螺科種類聚類, 且支持率較高。在基于CO1基因序列構建的系統樹中, 古氏非螺處于較為基部的位置(圖3)。在基于16S rRNA基因序列構建的系統樹中, 古氏非螺與Buccinulum linea聚為一支, Bootstrap支持率在80%以上(圖4)。

3 討論

齒舌是軟體動物重要的內部器官, 也是形態學分類的重要依據之一。如依據齒舌的形態和結構,Quadrasia屬從平軸螺科(Planaxidae)修訂到蛾螺科[15],Benthovoluta屬從渦螺科(Volutidae)修訂到拳螺科(Turbinellidae)[16]。古氏非螺的齒舌中央齒和側齒均具有 3枚齒尖, 符合張璽[17]和蔡英亞等[18]對蛾螺科齒舌的描述。蛾螺科與織紋螺科和盔螺科在親緣關系上較近, 三科種類的齒舌形態也最為相似。依據中央齒的形態和齒尖數目, 織紋螺科較容易與其他兩科的種類區分開來。但根據張璽[17]對蛾螺科和盔螺科的齒舌的描述, 兩者的差異并不十分明顯, 盔螺科“中央齒幾乎永遠具3個齒尖, 側齒通常具兩個不同的齒尖”, 一些蛾螺科種類, 如Antillophos屬種類的齒舌就符合這一特點[19]。因此, 僅依據齒舌的形態有時候并不能準確判斷一些種類的分類地位, 還需要其他證據的支持。

圖3 基于CO1基因序列通過鄰接法構建的系統發育樹Fig. 3 Molecular phylogenetic tree based on CO1 gene using NJ method

圖4 基于16S rRNA基因序列通過鄰接法構建的系統發育樹Fig. 4 Molecular phylogenetic tree based on 16S rRNA gene using NJ method

本文首次從分子水平證實了古氏非螺或非螺屬的分類地位?；贑O1和16S rRNA兩個基因片段構建的系統發育樹都顯示古氏非螺屬于蛾螺科, 支持Fraussen等[12]的觀點。造成16S rRNA基因片段NJ和 MP樹拓撲結構不一致的原因, 可能是該基因片段信息量較少的緣故。董長永等[20]基于核 28S rRNA基因分析了部分蛾螺科種類的系統關系, 結果表明香螺屬(Neptunea)是蛾螺科中較為進化的種類,這與本文的結果一致。CO1基因的進化速率比 16S rRNA更快[21], 具有更多的系統發生信息, 但由于本文研究的個體較少并未體現這一點。董長永等[20]基于 28S rRNA基因的變異程度認為水泡蛾螺(Buccinium pemphigum)和黃海蛾螺(B. yokomaruae)可能為同一個種或亞種。但28S rRNA基因高度保守,不適合種類的區分鑒定[22], 這種推斷可能并不準確。田瑩等[23]的研究結果表明, 水泡蛾螺和黃海蛾螺的齒舌具有明顯的差異。將分子標記和形態鑒定相結合, 建立物種間的系統發育關系, 是解決物種分類和鑒定難題的必然途徑[24]。

[1]Puillandre N, Cruaud C, Kantor Y I. Cryptic species inGemmuloborsonia(Gastropoda: Conoidea)[J]. Journal of Molluscan Studies, 2010, 76: 11-23.

[2]張愛菊, 尤仲杰. 分子生物技術在在貝類鑒定和分類上的應用[J]. 寧波大學學報(理工版), 2005, 18(3):404-409.

[3]Hayashi S. The molecular phylogeny of the Buccinidae(Caenogastropoda: Neogastropoda)as inferred from the complete mitochondrial 16S rRNA gene sequences of selected representatives [J]. Molluscan Research, 2005,25(2): 85-98.

[4]王瑩, 蘇成勇, 潘鴻春, 等. 基于線粒體CO1基因序列分析寶貝科主要類群的系統發生關系[J]. 動物分類學報, 2007, 32(1): 124-130.

[5]張愛菊, 尤仲杰. 基于 16SrDNA序列片段探討織紋螺的系統發生關系[J]. 動物分類學報, 2008, 33(3):549-552.

[6]Modica M V, Bouchet P, Cruaud C, et al. Molecular phylogeny of the nutmeg shells (Neogastropoda,Cancellariidae)[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2011, 59(3): 685-697.

[7]李榮冠, 江錦祥. 前鰓亞綱[M]//黃宗國. 中國海洋生物種類與分布. 北京: 海洋出版社, 2008: 490.

[8]張素萍, 李寶泉. 軟體動物門[M]//劉瑞玉. 中國海洋生物名錄. 北京: 科學出版社, 2008: 500.

[9]李榮冠, 黃宗國. 腹足綱[M]//黃宗國, 林茂. 中國海洋生物圖集(第四冊). 北京: 海洋出版社, 2012: 120.

[10]菱田嘉一. 世界海產貝類大圖鑒[M]. 東京: 久美株式會社, 2000: 250.

[11]賴景陽. 臺灣自然觀察圖鑒(13): 貝類[M]. 中國臺灣: 度假出版社, 2000: 104.

[12]Fraussen K, Hadorn R. Transfer ofAferConrad, 1858 to Buccinidae (Neogastropoda)with description of a new species from Western Africa [J]. Gloria Maris,2000, 38 (2-3): 28-42.

[13]Folmer O, Black M, Hoeh W, et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ from diverse metazoan invertebrates [J]. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 1994, 3: 294-299.

[14]Simon C, Frati F, Beckenbach A, et al. Evolution,weighting and phlogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers[J]. Annals Entomological Society of America, 1994, 87: 651-701.

[15]Houbrick R S. Transfer ofQuadrasiafrom the Planaxidae to the Buccinidae (Mollusca: Gastropoda: Prosobranchia)[J]. Proceedings of the Biological Society of Washington, 1986, 99(2): 359-362.

[16]黑田德米. ツ ノキフデの分 類 學上の位置[J]. 貝類學 雑 誌, 1965, 24(1): 50-52.

[17]張璽, 齊鐘彥. 中國經濟動物志: 海產軟體動物[M].北京: 科學出版社, 1962: 55-60.

[18]蔡英亞, 謝紹河. 廣東的海貝(修訂版)[M]. 廣東:汕頭大學出版社, 2006: 65-66.

[19]李海濤, 朱艾嘉, 方宏達, 等. 蛾螺科、織紋螺科和細帶螺科腹足類齒舌的形態學研究[J]. 海洋與湖沼,2010, 41(4): 495-499.

[20]董長永, 侯林, 隋娜, 等. 中國沿海蛾螺科5屬10種28S rRNA基因的系統學分析[J]. 動物學報, 2008,54(5): 814-821.

[21]蘇天鳳, 黃建華, 吳進鋒, 等. 2種東風螺線粒體基因序列多態性研究[J]. 中國水產科學, 2007, 14(3): 369-376.

[22]喻達輝, 朱嘉濠. 珠母貝屬6個種的ITS 2分子標記研究[J]. 南方水產, 2005, 1(4): 6-12.

[23]田瑩, 張素萍, 常亞青.黃渤海區蛾螺的齒舌研究[J].海洋科學, 2009, 33(10): 54-58.

[24]張亮, 黃艷艷, 劉煥章. 利用mtDNA 16S rRNA 序列差異鑒定江西青嵐湖的河蚌物種[J]. 水生生物學報,2004, 28(3): 294-299.